【摘 要】
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microRNA是一类小片段具有调控作用的小RNA。它响应胁迫主要是通过mRNA水平或蛋白质水平负调控靶基因。枣疯病是一类植原体病,在中国枣疯病发病普遍,是一个严重的问题。然而,人们对枣疯病的分子机制知之甚少。在本试验研究中,对采集的不同砧穗组合（枣/铜钱树砧、枣/本砧）的不同时间点新梢样品进行小RNA高通量测序和分析响应枣疯病的小RNA。本试验通过生物信息学分析、基因克隆等方法深入了解与铜钱树砧
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microRNA是一类小片段具有调控作用的小RNA。它响应胁迫主要是通过mRNA水平或蛋白质水平负调控靶基因。枣疯病是一类植原体病,在中国枣疯病发病普遍,是一个严重的问题。然而,人们对枣疯病的分子机制知之甚少。在本试验研究中,对采集的不同砧穗组合（枣/铜钱树砧、枣/本砧）的不同时间点新梢样品进行小RNA高通量测序和分析响应枣疯病的小RNA。本试验通过生物信息学分析、基因克隆等方法深入了解与铜钱树砧响应枣疯病相关miRNAs。获得的试验结果如下:（1）通过对枣/铜钱树砧、枣/本砧这种组合方式的小RNA高通量测序分析,发现小RNA主要分布区间为20-24nt,可见测序得到的小RNA主要是miRNA和siRNA。不同砧穗组合的miRNA在枣疯病病原接种后表现趋势不一样的上下调,这些受到枣疯病病原菌诱导上下调表达的小RNA对于枣应答枣疯病胁迫是非常重要的。（2）生物信息学分析差异小RNA,在测序文库中差异值大于2.5的共鉴定出40 个 miRNAs,高度同源 miR395 有三个分别为 miR395i、miR395a 和 miR395g。高度同源 miR399 有 miR399d、miR399a 和 miR399b 三个 miRNA,miR396 也有两个高度同源的分别为miR396b和miR396c。由前体5’端加工而来的miRNA有miR395i-p5 和 miR399a-p5,由前体 3’ 端加工而来的 miRNA 有 miR168a-3p、miR2592bj-p3和miR2603-p3。另外,预测了 40个miRNAs的靶基因多是未知蛋白,也有与激素和抗病相关的转录因子。（3）筛选出2条与枣/铜钱树砧、枣/本砧组合相关的microRNA（miRNA）,经miRBase数据库比对鉴定为miR396c和miR2603。实时定量分析了 miRNAs与靶基因是剪切的关系。（4）酸枣瞬时转化,取根叶做miR396c和miR2603和靶基因的表达模式分析,发现miR396c和miR2603和靶基因的表达模式相反,初步认为miR396c和miR2603的预测靶基因的正确性。（5）在本氏烟草中利用VIGS技术瞬时注射miR396c和miR2603,烟草出现分枝和腋芽,实时定量分析miR396c和miR2603及其对应烟草靶基因的表达关系,验证miR396c和miR2603是在分枝中起到了作用,与枣疯病分枝表型联系。（6）过量表达miR396c和miR2603的前体基因,转化烟草,获得转基因株系,miR396c和miR2603前体基因在烟草中表达水平明显高于野生型。选取转miR2603的14和18阳性株系,接种PstDC3000病原菌发现,转基因株系不抗病。对转miR2603的14和18阳性株系先注射靶基因再接种PstDC3000病原菌发现注射了靶基因的野生型株系抗病,进一步做了植物逆境应答相关的生理指标过氧化氢含量略高于野生型,试验结果表明miR2603转基因烟草不抗病,但靶基因V8存在抗病的可能性很高。我们的研究结果为深入了解枣疯病发生的分子机制提供了一定的试验基础。
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