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研究背景睑裂狭小、倒转型内眦赘皮和上睑下垂综合征(blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome,BPES)的发病率为 1/5,000,作为一种罕见的常染色体显性遗传病,它的主要临床表现是双侧上睑下垂、睑裂狭小、逆向内眦赘皮、内眦间距过宽等,次要表现是鼻梁扁平、低位耳等。BPES共分为两型:Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型表现为眼睑发育异常并且受累女性伴有不孕,Ⅱ型仅仅表现为眼睑发育的异常,男女患者生育功能未受影响。两型的主要区别主要是Ⅰ型受累女性同时伴有不孕症,然而由于BPES Ⅰ型女性的基因型与表型并不完全一致,其所引起的女性不孕的发病机制尚不明确。迄今为止,临床上尚未找到可靠有效的方法来治疗BPES Ⅰ型患者的不孕症。虽然可以通过重建手术来矫正BPES患者的上睑下垂,以改善其面貌,但BPES Ⅰ型所伴发的不孕症给女性患者造成身心上的巨大痛苦。此外,由于BPES患者尤其是Ⅰ型女性患者的临床表型变异程度较大,使得临床医生较难对该病进行准确的诊断,从而使该类患者无法得到及时有效的治疗。更重要的是,该病具有较高的家族遗传性,根据孟德尔遗传定律计算,BPES患者子代的再发病风险约为50%,因此对BPES患者进行常规的产前遗传咨询,通过产前筛查、诊断等必要措施避免患病儿的出生就显得尤为重要。Forkhead boxL2(FOXL2)基因是定位于染色体3q23(3号染色体2区3带)的单一外显子基因。FOXL2基因是一个在维持卵泡发育、卵巢正常功能中发挥重要作用的常染色体基因,主要在中小卵泡期的颗粒细胞中表达,通过抑制下游靶基因CYP11A1、CYP1941、CCND2等启动子的转录活性,从而在卵泡颗粒细胞的增殖、分化、卵巢类固醇激素的生成过程中发挥重要作用。FOXL2基因突变会导致卵巢早衰的发生。研究表明FOXL2基因是BPES最常见的、首位致病候选基因,在BPES Ⅰ型和Ⅱ型患者中均发现有FOXL2基因突变的存在。但FOXL2基因突变如何对下游基因启动子的转录功能产生影响、引起POF并导致BPES不孕症发生的具体分子机制尚未完全明确。研究目的本研究中,我们主要关注FOXL2基因突变在BPES Ⅰ型患者不孕症发生发展中的作用机制。我们对一个BPES不孕症家系进行家系遗传学分析、对FOXL2基因突变进行筛查并对新发突变进行功能预测和体外实验功能验证,从而探讨FOXL2基因突变与该家系患者不孕症发病的相关性,以期给相关不孕症病人的临床诊疗及遗传咨询等提供更多的依据和帮助。研究方法1.以2015年就诊于山东大学附属生殖医院的伴有BPES表现的不孕症患者的家系为研究对象,对家系成员进行临床表型及遗传规律分析。2.抽取家系成员的外周血,以在本院招募的223例卵巢功能正常且不伴有BPES的育龄期健康妇女外周血为正常对照,采用直接测序法对FOXL2基因的外显子区进行突变位点筛查检测。3.应用生物信息学软件Polyphen-2、PROVEN和SIFT等对FOXL2基因突变对蛋白质的影响进行功能预测。4.构建野生型和突变型FOXL2基因质粒,转染至HEK293细胞后,采用双荧光素酶报告系统检测基因转录活性、细胞免疫荧光技术检测蛋白表达及细胞定位。研究结果1.家系中的两例患者均符合BPES的临床诊断,且受累的女性均患有不孕症,符合BPES分型中的I型,遗传方式符合单基因常染色体显性遗传方式。2.在该BPES不孕症家系中发现了FOXL2基因编码区第188位的胸腺嘧啶突变为腺嘌呤,为新发突变c.188I>A,第63位氨基酸由Ile变为Asn(p.I63N),突变位点位于FKH结构域,该突变位点(p.I63N)及其上下游序列在物种间高度保守。3.功能预测提示p.I63N突变对FOXL2蛋白功能有损害。这个新发突变位点为我们首次发现。4.体外转染HEK293细胞的功能实验证实,该错义突变p.I63N减弱了FOXL2对下游基因CYP19A1和CCND2启动子的转录抑制作用(P<0.05),但对CYP11A1启动子的转录抑制无明显影响(P>0.05),而且对CYP11A1、CYP19A1和CCND2三个下游靶基因的启动子都没有显性负效应;亚细胞定位及蛋白表达定位同野生型相比未见明显改变。研究结论1.对一个不孕症家系进行家系分析,符合BPES的临床诊断,患者有典型的眼睑异常并伴有不孕症属于Ⅰ型BPES患者。2.在患者FOXL2基因中检测到了一个新发突变,位于第188位碱基的胸腺嘧啶突变为腺嘌呤(c.188T>A),导致第63位氨基酸的异亮氨酸变为天冬酰胺(p.Ile63Asn,p.I63N),该突变位于FKH结构域,拓展了BPES基因错义突变谱。3.蛋白功能预测软件显示,p.I63N突变对FOXL2蛋白功能的影响较大。4.突变p.I63N有可能通过单倍剂量不足的机制,影响FOXL2对下游调控基因CYP19A1和CCND2启动子的转录抑制,进而导致颗粒细胞功能及类固醇激素生成的异常,最终导致不孕症的发生。该研究揭示了该BPES家系女性患者不孕症发生的可能机制,为BPES的进一步研究提供了实验依据。