【摘 要】
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贝莱斯芽孢杆菌是一种常用的生防菌,能有效抑制多种病原细菌和真菌。本论文在优化贝莱斯芽孢杆菌zk1滤液抑菌效果的基础上,提取脂肽类抑菌物质并通过LC-MS对其进行鉴定,通过观察细胞结构、分析相关生化指标,推测脂肽类抑菌物质在细胞水平的抑菌机理,最后基于GC-MS和LC-MS双平台技术对经脂肽类物质处理后的胶孢炭疽菌进行非靶向代谢组学研究,比较对照组和处理组菌丝中显著变化的代谢物,映射到相关的代谢通路
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贝莱斯芽孢杆菌是一种常用的生防菌,能有效抑制多种病原细菌和真菌。本论文在优化贝莱斯芽孢杆菌zk1滤液抑菌效果的基础上,提取脂肽类抑菌物质并通过LC-MS对其进行鉴定,通过观察细胞结构、分析相关生化指标,推测脂肽类抑菌物质在细胞水平的抑菌机理,最后基于GC-MS和LC-MS双平台技术对经脂肽类物质处理后的胶孢炭疽菌进行非靶向代谢组学研究,比较对照组和处理组菌丝中显著变化的代谢物,映射到相关的代谢通路,从而推测脂肽类物质对致腐真菌的抑菌机理,旨在为鹰嘴桃采后致病菌的防控、延长桃果的商品货架期提供依据。主要研究结果如下:（1）贝莱斯芽孢杆菌zk1菌液和滤液对鹰嘴桃腐败真菌均有一定的抑菌效果,其中对胶孢炭疽菌和哈茨木霉的抑制作用优于白色念珠菌和黑曲霉。菌株zk1滤液抑菌效果的单因素和正交实验结果表明,在试验范围内菌株zk1最优的发酵条件为:转速170 r/min、p H 6.0、NB培养基在37℃条件下培养60 h。酸沉淀法提取菌株zk1滤液中的10 mg/m L脂肽粗提物对胶孢炭疽菌和哈茨木霉的抑菌率分别为57.59%和83.16%。LC-MS鉴定结果表明菌株zk1发酵液中可能含有脂肽类化合物泛革素和表面活性素,推测脂肽粗提物主要通过泛革素和表面活性素对鹰嘴桃腐败真菌发挥抑制作用。（2）经10 mg/m L脂肽粗提物处理后,胶孢炭疽菌和哈茨木霉的显微镜和电镜观察结果发现:处理组的胶孢炭疽菌孢子萌发畸形,菌丝体表面皱缩、干瘪,细胞内部形成大空腔、细胞器减少;哈茨木霉菌丝分支减少,菌丝体表面凹凸不平,细胞器模糊,呈现无序状态。相关生化指标结果表明:脂肽粗提物能增大胶孢炭疽菌和哈茨木霉的细胞膜通透性并破坏其细胞壁完整性,其胞外电导率、胞外核酸泄露量以及AKP活性随着处理时间的延长而显著提高;菌丝体膜脂过氧相关的MDA含量和CAT活力相比对照组显著上升,且在一定范围内脂肽粗提物浓度越高上升越明显;与抗氧化相关的SOD和POD,其处理组的整体变化趋势为前期急剧升高后期逐渐降低,而对照组呈现缓慢上升的变化趋势。综上推测脂肽类物质的抑菌机制为破坏真菌的细胞膜通透性和细胞壁完整性,造成菌丝细胞成分的外流并导致胞内生化反应被破坏,从而抑制细胞的正常生长。（3）基于GC-MS和LC-MS双平台的非靶标代谢组学从代谢水平推测脂肽类物质对胶孢炭疽菌的作用机制为:抑制几丁质和甘露聚糖的合成和加速其降解,从而破坏胶孢炭疽菌细胞壁完整性,抑制细胞正常生长;通过下调UFA/SFA比率,改变细胞膜脂肪酸的构成,降低细胞膜流动性,扩大细胞膜通透性,破坏细胞膜完整性,导致细胞内容物外泄;促进嘌呤核苷酸的分解代谢并降低其从头合成代谢;通过干扰氨基酸代谢影响蛋白质合成;抑制糖酵解和能量供给,进而影响细胞内代谢;干扰维生素正常代谢,削弱细胞生理功能和降低细胞活性。综上可知,脂肽类物质抑制胶孢炭疽菌的作用方式是多靶点、多途径的。
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