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神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是起源于原始神经嵴的胚胎性恶性肿瘤,发病率占小儿恶性肿瘤的6%~10%,其死亡率占儿童恶性肿瘤的12%~15%,为儿童时期最常见颅外实体瘤。高危神经母细胞瘤(HR-NB)占NB的60%以上,随着化疗方案的改进以及综合治疗的开展,NB的预后明显得到了改善,但对于高危组NB患儿即使通过化疗、放疗、手术、自体外周血干细胞移植等多模式高强度的治疗,其5年生存率仍低于40%,并有40%~50%的患儿会出现复发现象。在NB的发生过程中,其最大的特点是在同一肿瘤样本同一时期存在不同分化阶段的肿瘤细胞,这种特性与分化障碍密切相关。多数4S期NB具有自行消退的特点,即神经母细胞分化为成熟的神经节细胞。具有自我分化潜能的NB患儿具有良好预后,而广泛转移的NB患者,其预后差、易复发。微小残留灶的存在为NB易复发的原因之一,临床上应用异维甲酸进行诱导分化。但对于接受异维甲酸维持治疗的患者,其5年总生存率(OS)仍然只有60%左右。PLK4在中心粒复制的调节中具有重要作用,PLK4表达异常会导致细胞有丝分裂缺陷,从而导致肿瘤的发生发展。PLK4异常表达与乳腺癌、肝癌、卵巢癌、急性淋巴瘤等预后不良相关。在NB中,PLK4呈内源性高表达状态,并且具有促进NB细胞迁移、侵袭以及促进裸鼠体内种植瘤的生长和转移能力。基于此现象,研究者们将PLK4作为临床治疗靶点之一,研发出多种针对PLK4的抑制剂,如:CFI-400945、YLT-11、Centrinone等。PLK4抑制剂Centrinone具有抑制中心粒复制、延迟细胞有丝分裂的的作用。本文旨在研究PLK4抑制剂Centrinone及其与全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)联合用药时,对NB细胞中心粒复制、DNA损伤及细胞功能的影响。研究方法:1.验证PLK4在NB及节细胞神经瘤中的表达采用免疫组化和Western blot实验验证PLK4在NB组织和细胞系以及PLK4在节细胞神经瘤中的表达情况。2.验证PLK4抑制剂Centrinone对NB细胞功能的影响(1)运用MTT实验检测PLK4抑制剂Centrinone在NB细胞系中的IC50值;(2)利用平板克隆实验、Western blot实验验证PLK4抑制剂对NB细胞系增殖、分化及凋亡的影响;3.利用Western blot实验验证PLK4抑制剂Centrinone对中心粒复制以及对DNA损伤修复的影响;4.利用ATRA对NB细胞系进行诱导分化,Western blot实验检测Rac1、Rho A、S-100、NSE等分化相关指标的表达变化,建立NB细胞分化模型并验证分化后PLK4、P-PLK4(S305)、γ-tublin的表达;5.将PLK4抑制剂Centrinone与ATRA联合应用,加入NB细胞中,验证二者联合用药对NB细胞增殖、迁移、分化及凋亡的影响,并检测γ-tublin、53BP1、BRCA1的表达。结果:1.通过检测患者肿瘤组织样本,发现PLK4在高危组NB的表达量高于低危组NB以及良性节细胞神经瘤。2.通过MTT实验检测PLK4抑制剂Centrinone的IC50值,SK-N-Be(2)细胞系IC50值为346.5n M,SH-SY5Y为287.1n M。且加入抑制剂后,出现抑制细胞增殖、促进细胞分化和凋亡现象。3.在NB细胞中加入PLK4抑制剂Centrinone后,γ-tublin表达下降,P53以及BRCA1表达增加,53BP1表达下降。4.应用ATRA建立分化模型后,γ-tublin表达下降。5.PLK4抑制剂Centrinone与ATRA联合用药加入NB细胞后,细胞生长明显受到抑制(P<0.05),增殖能力较单用Centrinone和ATRA明显减弱;细胞迁移能力降低,但较单用Centrinone未见明显差异(P>0.05);并且Rac1的表达较单药组表达增强、Rho A表达降低;Cleaved-Casepase3以及PARP-1剪切蛋白的表达量较单药组明显增强;γ-tublin的表达较单药组未见明显差别;此外,联合加药后,BRCA1、53BP1的表达量均减少。结论:1.PLK4在NB组织及细胞中呈高表达状态。2.PLK4抑制剂Centrinone具有抑制细胞增殖,抑制中心粒复制,促进细胞分化和凋亡以及促进DNA损伤的作用。3.ATRA具有抑制中心粒复制的作用。4.Centrinone与ATRA相联合其抑制细胞增殖、促进细胞分化及促细胞凋亡的能力较单用Centrinone和ATRA增强;此外,联合用药具有促DNA损伤能力,并且可抑制DNA损伤后的修复。