肠道病毒相关的手足口病/咽峡炎主要病原有肠道病毒71型(enterovirus71, EV71)、柯萨奇病毒A组(Coxasckievirus A group, CVA)2、4、5、7、9、10、16型与柯萨奇病毒B组(Coxasckievirus B group, CB)1、2、3、4、5,以EV71和CVA16最常见。肠道病毒相关手足口病/咽峡炎病程中除了最常见的发热与出疹症状外,还可见呼吸道感染、肝损伤、心肌损伤、脑膜炎、脑炎与急性弛缓性麻痹等并发症。病原学监测显示不同地区在不同时间流行的肠道病毒基因型可有所不同。近年来众多国家地区流行的肠道病毒基因型构成发生显著改变,一些地区出现特定基因型肠道病毒的小范围流行,引起爆发性脑炎或脑膜炎。我们以广东省手足口病收治定点医院(珠江医院)2009-2013年的肠道病毒急性感染患者为研究对象,对疑似肠道病毒相关手足口病/咽峡炎患者的肛拭子标本进行肠道病毒、EV7、CVA16实时荧光逆转录PCR检测,并对部分源自住院患者感染的non-EV71/non-CVA16肠道病毒进行VP1和／或5’-UTR基因部分片段RT-PCR扩增,进而进行测序比对分型。收集整理的手足口病/咽峡炎临床资料,结合不同年份的肠道病毒分型资料,以阐明2009-2013年间广东地区手足口病/咽峡炎中的肠道病毒基因型、不同基因型的疾病特征及并发症构成。统计分析采用SPSS13.01版软件(SPSS, Chicago, IL, USA),构成比与率的比较采用卡方检验：最小期望频数>5的样本比较采用Pearson卡方检验,最小期望频数≤5采用Fisher精确检验,以双侧P<0.05为有显著性差异。本研究分以下三个部分：Ⅰ2010-2013年广东地区肠道病毒急性感染的流行病学及基因型2009-2013年珠江医院共检测到2484例肠道病毒感染相关手足口病/咽峡炎儿童患者,其中住院患者1014例,门诊患者1470例,共有321例2010-2013年non-EV71/non-CVA16感染的住院患者感染的肠道病毒成功进行测序分型鉴定。珠江医院2010-2013年间不同年份检测的EV7、CVA16与其他基因型肠道病毒(other EVs)构成比差异显著(x2=502.5；P<0.001),资料显示2010-2013年期间广东省流行的肠道病毒基因型发生以下重大改变：EV71感染患者占所有肠道病毒感染患者比例从2010年的48.7%降至2013年7.3%；CVA16感染患者占所有肠道病毒感染患者的比例从2010年的21.8%下降至2013年的8.6%;other EVs感染患者占当年所有肠道病毒感染患者的比例从2010年的29.8%上升至2013年的81.4%。2010-2013年手足口病/咽峡炎住院患者的肠道病毒基因型发生类似改变。2010-2013肠道病毒感染呈明显季节性分布,多集中于5-8月,但不同年份高峰月份稍有波动,且EV7、CVA16与Other EVs感染高峰月份存在些许差异。5-6月、6月、5-7月与5月；CVA16在2010-2013年间的发病高峰依次为5月、无高峰、5月与5月；Others EVs依次为：6月、6-7月、5月与5-7月。患者以5岁以下儿童为主：≤5岁病例占总病例数的93.5%,2009-2013年的≤5岁的肠道病毒感染患者占当年肠道病毒急性感染患者的比例分别为95.8%、94.6%、95.8%、92.8%与81.6%,其中13m-36m患儿在2009-2013的各个年度中均超过一半以上,分别为71.6%、57.0%、58.2%、50.3%和53.0%。为明确广东省2010-2013年间other EVs感染手足口病/咽峡炎患者感染的肠道病毒基因型的构成及其演变,我们对部分住院患者来源的肠道病毒进行基因测序分型,最终321例non-EV71/non-CVA16感染的手足口病/咽峡炎住院患者成功进行基因分型,其中2010、2011、2012、2013年non-EV71/non-CVA16住院患者中获得基因分型的病例数分别为45、84、101和91例。2010、2011、2012、2013的non-EV71/non-CVA16住院患者样本中分别鉴定出6、12、16和6种non-EV71/non-CVA16肠道病毒基因型。2010-2013年珠江医院鉴定出的non-EV71/non-CVA16肠道病毒感基因型构成及演变呈如下特点：柯萨奇病毒占绝对主导地位,分别占2010、2011、2012、2013年获得测序分型的non-EV71/non-CVA16感染住院患者的97.8%、97.6%、86.1%与100%；CVA6是non-EV71/non-CVA16肠道病毒住院患者的优势致病基因型,CVA6感染患者占2010、2011、2012、2013年的non-EV71/non-CVA16获得测序分型的住院患者比例分别是68.9%、58.3%、54.5%和81.1%；echovirus相关手足口病/咽峡炎在各个年份中均为孤立的散发病例；2012年住院患者感染的echovirus基因型种类及其感染的病例数上升显著,共检测出8种Echo基因型及14例患者,其他年份为1-2种及1-2个孤立病例。·为明确2010至2013年手足口病/咽峡炎住院患者的并发症构成有无改变,本研究在排除先天性心脏病、发病前有神经系统疾病及病程中有明显的细菌感染患者后,2010-2013年共有882例手足口病/咽峡炎住院患者纳入研究,各年份的病例数分别为：214(2010)、326(2011)、204(2012)及138(2013)。研究显示2010-2013年珠江医院肠道病毒感染住院患者并发症均有神经系统受累、呼吸系统感染、肝损伤、心肌损伤与腹泻。2010至2013年肠道病毒相关手足口病/咽峡炎的并发症构成比发生重大改变。肠道病毒感染住院患者合并CNSL神经系统受累)与SCNSI(严重神经系统受累)的百分率自2011年显示下降趋势,2010-2013年各年份MCNSI发生率依次是14.5%、27.6%、14.7%、10.1%,SNCSI发生率依次为16.8%、7.1%、12.7%、2.2%,,二者均呈下降趋势,2012年SCNSI(12.7%)与2011年的(7.1%)相比有反弹。MARI%自2011年开始显示增高趋势,各年份分别为：21.0%、16.6%、22.5%、37.7%。部分住院患者出现严重的呼吸道感染,2010-2013年SARI%各年份分别为：16.4%,11.0%,19.6%,13.8%。肠道病毒感染可导致心肌损伤、肝脏损伤及腹泻,2010-2013年份肠道病毒感染住院患者心肌损伤发生率波动在1.2%-10.1%之间,肝损伤发生率波动在3.1%-8.0之间,腹泻发生率为2.8-6.4%。Ⅱ不同基因型肠道病毒相关手足口病/咽峡炎住院患者的临床特征为阐明各肠道病毒感染基因型的临床特征,本研究在排除有先天性心脏病、发病前有神经系统疾病及病程中有明显的细菌感染患者后、多种肠道病毒基因型共感染住院病例后,2009-2013个肠道病毒基因型相关手足口病/咽峡炎住院患者病例数量如下：EV71感染409例、CVA16感染169例、CVA6感染207例、CVA4感染19例、CVA10感染41例、Echo感染17例、其他柯萨奇病毒感染36例。不同肠道病毒基因型感染相关手足口病/咽峡炎均具有以下共同特征：发热出疹均是各种肠道病毒基因型中最常见的症状,皮疹中均可见疱疹、丘疹、斑疹,各种皮疹中均以疱疹最常见；呼吸系统感染常见,除EV71外,是各种肠道病毒基因型感染住院患者中仅次于发热出疹的并发症；5岁以下儿童均占各型肠道病毒感染90%以上,男性儿童均多于女性儿童；均可检测到与患者心肌损伤及肝损伤相关的酶学异常。不同基因型肠道病毒感染相关手足口病/咽峡炎病例的比较显示各基因型肠道病毒感染住院患者呈以下特征：EV71与Echo是感染住院患者死亡的致病原,死亡率率分别为11.8%与3.2%,CVA(4、6、10、16)感染无死亡患者；各肠道病毒基因型感染住院患者均可出现中枢神经系统受累,CNSI发生率最高的为EV71(50.6%),其次是Echo(29.4%)与CVA4(26.3%),最低的是CVA16(2.4%),CVA10(12.2%)与CVA6(10.1%)住院患者的CNSI发生率均较低；EV71与Echo感染住院患者的SCNSI发生率较高,分别为20.0%与23.5%,而CVA4((5.3%)、CVA10(2.4%)、CVA16(0.6%)与CVA6(0.0%)的SCNSI发生率低；EV71是导致瘫痪的最主要致病肠道病毒基因型,EV71感染住院患者病程中出现瘫痪的发生率为6.6%,CVA16感染住院患者1例患者病程中出现瘫痪,发生率为0.6%,其他基因型感染住院患者未见瘫痪病例；EV71、Echo、CVA4、CVA10、CVA6与CVA16均有较高的呼吸系统感染发生率,以CVA4最高(63.2%),EV71最低(30.1%)；心肌损伤以Echo最常见(23.5%),CVA16最低(5.9%)；腹泻发生率以Echo最高(11.8%),其次是CVA6(3.9%)、EV71(2.4%)、CVA16(0.6%)、CVA4与CVA10均未发现腹泻病例；各肠道病毒基因型感染住院患者的肝损伤(谷丙转氨酶ALT)发生率均较低,波动在1.8%-6.7%之间,以Echo发生率最高(6.7%),CVA16最低(1.8%)。总结27例病程中出现瘫痪的EV71感染住院患者的临床特征显示：EV71感染可出现0-4级各种程度的瘫痪；EV71感染侵犯各个脊髓节段以及颅神经；以侵犯运动神经为主,但感觉神经亦可受累；可同时侵犯不同部位的中枢神经；近六成患者出现不同程度的后遗症。心肺功能衰竭是13例EV71感染死亡的最直接原因,13例死亡患者均存在心肺功能衰竭,2例死亡合并脓毒症导致的多器官功能衰竭。心肺功能衰竭诱因有神经源性肺水肿、肺炎与气胸。EV71和CVA16的分子流行病学调查显示2009-2012年广东流行的EV71病毒株均为C4a亚型,而CVA16病毒株存在B1a与Blb亚型两种共流行。98株来自2009-2012年手足口病/咽峡炎样本的EV71全长VP1构建进化树显示广东此期间流行的EV71病毒株均是C4a亚型,VP1氨基酸序列分析显示重症与死亡患者来源的EV71病毒株与轻症手足口病/咽峡炎来源的病毒株的VPl序列无显著差异,未发现特定位点的氨基酸替换与EV71感染病情的严重性相关。35株来自2009-2012年手足口病/咽峡炎样本的CVA16全长VP1序列构建的进化树显示广东此期间流行的CVA16病毒株均是Bla与Blb亚型,各个年份均存在此2种亚型的CVA16病毒株流行。Ⅲ肠道病毒相关手足口病/咽峡炎特殊病例研究肠道病毒相关手足口病/咽峡炎合并急性胃肠炎的临床特征。2009—2012年的804例肠道病毒感染住院患者中共有30例急性胃肠炎患者(3.7%)。26例成功鉴定感染基因型的例急性胃肠炎患者中,EV71感染10例(38.5%)、CVA6感染7例(26.9%),CVA10感染3例(11.5%),CA(4,9,16,21)与Echo(2,14)感染各一例,4例未成功进行分型。30例患者的消化道症状大多轻微,轻症急性胃肠炎占所有急性胃肠炎86.7%例,以腹泻(93.3%)常见,腹部疼痛(6.7%)与严重脱水(10%)少见、腹泻持续时间大多短暂(1-4d占78.6%)、短期非频繁呕吐者居多(呕吐≤2天占83.3%和呕吐≤4次/天的占75%)。急性胃肠炎组的多器官功能障碍综合症(MODS)(10.0%vs0.40%)(P=0.001)、ALT增高(13.3%vs3.2%)(P=0.013),心肌酶谱增高(23.3%vs6.1%)(P=0.003)和惊厥(23.3%vs7.1%)(P=0.006)的发生率均显著高于非急性胃肠炎组,但死亡率(6.7%vs1.6%)(P=0.093)、意识改变(13.3%vs8.4%)(P=0.316), SARI(23.3%vs15.2%)(P=0.229), ARI (40.0%vs41.0%)(x2=0.110,P=0.917), SCNSI(16.7%vs11.4%)(P=0.378)和MCNSI(23.3%vs20.8%)(x2=0.112, P=0.738)两组间均无显著差异。肠道病毒感染无皮疹患者与有皮疹患者的临床特征比较。2009—-2012的804例肠道感染住院患者中,病程中未出现皮疹者91例,出疹病例713例。非出疹组的死亡非出疹组的死亡(6.6%vs1.1%)(p=0.001), SCNSI (18.7%vs10.7%)(P=0.024), SCNSI+心肺功能衰竭(7.7%vs2.8%)(P=0.015)、意识改变(15.4%vs8.4%)(x2=7.808, P=0.005)及惊厥发生率(14.3%vs6.9%)(x2=6.232, P=0.020)均显著高于出疹组。2009-2013年流行于广东的不同肠道病毒基因型在肠道病毒急性感染儿童中的出疹发生率有差异。不同肠道病毒基因型的非出疹概率由高到低依次是37.5%(埃可病毒)、28.0%(其他柯萨奇病毒)、13.1%(CVA16)、12.8%(EV71)、6.3%(CVA4)、3.2%(CVA10)与2.3%(CVA6)。CVA16相关肾病综合征。发现一例CVA16相关手足口病中出现肾病综合征病例。此患者病程中先后出现皮疹、眼睑浮肿、低蛋白血症(血清白蛋白11.3g/L)少尿、蛋白尿、高血脂(TC7.48mmol/L, TG2.76mmol/L, HDLC1.65mmol/L、 LDLC5.38mmol/L, LPa2407mg/l, ApoA12.11g/L, ApoB1.93g/L)。其他的肾病综合征致病因素检查：HBsAg-C0IU/ml(0-0.05), HBsAb-C324.03IU/ml (0-10)、抗核蛋白抗体与抗双链DNA抗体均阴性、anti-streptolysin与rheumatoid factor阴性。据以上三个部分研究成果,总结如下：·2010-2013年广东地区流行的肠道病毒相关的手足口病/咽峡炎的基因型构成发生重大变动,EV71与CVA16从优势肠道病毒基因型转变为非优势肠道病毒基因型,CVA6从非优势基因型转变为主导基因型。2010-2013年广东地区有多种肠道病毒基因型共流行,2010、2011、2012、2013住院手足口病/咽峡炎来源的样本中分别鉴定出8、14、18和8种肠道病毒基因型。·2009-2012年广东流行的EV71均是C4a基因亚型,而CVA16有B1a与B1b两种基因亚型共流行,EV71感染重症患者与轻症患者的VPl氨基酸序列无显著差异,未发现VP1特定位点的氨基酸替换与EV71相关手足口病/咽峡炎疾病的严重性相关。·2009至2013年广东省的肠道病毒相关手足口病/咽峡炎感染患者的并发症构成比发生重大改变,住院患者急性呼吸道感染发生率逐年增高,CNSI与SCNSI百分率自2010年起显著下降,肠道病毒相关手足口病/咽峡炎的危害性下降。·EV71是2010-2013年广东省手足口病/咽峡炎患者出现严重神经系统受累、死亡、瘫痪的最主要肠道病毒基因型。心肺功能衰竭是EV71感染死亡最直接的原因,但肺部感染以及脓毒症导致的多器官功能障碍也是EV71感染死亡原因之一。EV71感染可导致0-4不同级别的瘫痪,脊髓不同节段及颅神经均可受累、以侵犯运动神经为主,但感觉神经亦可受累,病程中出现瘫痪的患者近六成有不同程度的瘫痪后遗症。·柯萨奇病毒相关手足口病/咽峡炎病情大多轻微,住院患者并发症以呼吸道感染为主,神经系统受累发生率低。·埃可病毒相关手足口病/咽峡炎住院患者死亡率高、严重神经系统受累、心肌损伤发生率以及无皮疹发生率均高于其他肠道病毒基因型。·肠道病毒相关手足口病/咽峡炎合并急性胃肠炎以轻型胃肠炎为主,合并急性胃肠炎患者的多器官功能障碍综合症(MODS)、肝脏损伤、心肌损伤和惊厥的发生率均显著高于非急性胃肠炎组,但两组间的死亡率、意识改变、SARI、 ARI、SCNSI和MCNSI均无显著差异,提示急性胃肠炎对手足口病病情影响有限。·肠道病毒感染病程中无皮疹者比出疹者病情严重：前者的死亡率、心肺功能衰竭、意识障碍及惊厥发生率均显著高于后者,提示临床医师应重视无皮疹的肠道病毒感染患者。·观察到一例CVA16相关的肾病综合症病例。