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环曲病毒、萨佩罗病毒和捷申病毒被发现均与腹泻密切相关,且存在着共感染现象,在猪肠道病毒流行病学上越来越引起人们的关注和重视。环曲病毒属于冠状病毒的一种,在本课题中被用来研究冠状病毒引起的猪亚临床肠道疾病所致肠道细胞机能变化。萨佩罗病毒和捷申病毒同属于小RNA病毒科,在本研究中被作为引起猪临床和亚临床腹泻综合征的小RNA病毒代表,探讨肠道感染病毒所致的肠道细胞机能变化。LOX-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein-1),作为Ox-LDL的受体,参与机体脂质代谢,促进机体炎症反应,影响细胞的生长分裂和细胞骨架结构,导致组织损伤,反应机体的疾病病理状态,被本实验室先前研究发现在萨佩罗病毒感染小肠绒毛上皮细胞(IPEC-J2)的病理过程中呈现明显上调。目前关于不同种属肠道病毒的比较性研究很少,也未见关于环曲病毒、萨佩罗病毒或捷申病毒引起肠道细胞机能性变化的相关研究。同时,LOX-1虽被证实与人的炎症相关病理变化甚至是癌症发生有关,但是,LOX-1是否在病毒引起的慢性炎症反应中发挥一定的作用还未可知。因此,我们拟在探究环曲病毒、萨佩罗病毒和捷申病毒感染IPEC-J2细胞引起的细胞病理发生过程的基础上,进一步探讨LOX-1在肠道病毒感染肠道细胞过程中发挥的潜在作用及其信号功能。1.环曲病毒的鉴定流行病学调查显示,环曲病毒在上海地区有流行,感染率为5.5%。在牛环曲病毒基因组全长的基础上,我们获得了猪环曲病毒的全长基因组序列(28301bp),进一步扩充了环曲病毒的有限基因组信息。全长序列中碱基的缺失和替换主要发生在非结构基因ORF1a上。和牛环曲病毒及马环曲病毒相比,猪环曲病毒SH1株分别缺失了28个碱基和152个碱基。将阳性粪便样品回归感染巴马小型猪,可观察到环曲病毒在感染猪上周期性随粪便排出,每5~6天为一个病毒复制和排毒周期。环曲病毒还会引起同居感染。未感染猪接触感染猪3天以上则可被感染并出现排毒现象。这说明通过粪便途径采集样品时,一部分感染猪可能处于非排毒期。因此我们认为实际猪场中的环曲病毒感染率应该更高。2.捷申病毒的分离鉴定捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)在上海地区的感染率高达82.2%以上。VP1分型结果显示,除了主要血清型4、8和10外,新血清型PTV wild boar/WB2CTV/2011/HUN流行程度也较高,血清型3和另一血清型PTV SH8比较少。本研究分离出上海主要流行株PTV4 SH1。PTV4 SH1和PTV4 10BJ02相似度最高,序列一致性高达90%。但是,相对于PTV4 10BJ02,PTV SH1的VP2蛋白缺失了4个氨基酸序列。SH1株的5’端与PTV8 Jinlin/2003/02和PTV8 Fuyu/2009/02非常一致,都缺乏其他株基因组中的poly(C)序列。3.环曲病毒感染对IPEC-J2细胞机制的影响本研究应用猪环曲病毒的木瓜样蛋白酶和3C样蛋白酶来对环曲病毒进行功能分析。木瓜样蛋白酶在IPEC-J2细胞中主要分布于细胞核区,3C样蛋白酶主要定位于细胞质。蛋白酶的表达会导致细胞的凋亡,诱导微丝的解聚和消融,细胞骨架发生重排,细胞周期被完全阻碍在G2/M期。在蛋白酶过表达的IPEC-J2细胞中,细胞内NO水平提高,胞浆内活性氧水平下降,但线粒体内活性氧水平上升。蛋白酶还能够促进IFN-α、TNF-α,IL-1α和TGF-β的m RNA水平升高,上调LOX-1,STAT2和RIG-I的转录水平。同时,环曲病毒蛋白酶过表达细胞中LOX-1和STAT2的蛋白表达增加。但是RIG-I的蛋白表达可被蛋白酶所抑制。4.萨佩罗病毒感染对IPEC-J2细胞机制的影响萨佩罗病毒的感染能够引起IPEC-J2细胞的渐进性变化。在病毒复制的前期,少量细胞发生凋亡;感染24h后,大量细胞开始进入后期凋亡或发生坏死。病毒感染的末期,细胞周期多数停留在G2/M期,细胞内氧化应激水平和NO生成呈爆发式增长。在病毒感染的过程中,宿主细胞骨架发生重排,应力纤维结构遭到破坏,微丝聚集变粗,并逐渐向细胞边界聚拢。细胞内的一系列炎症相关细胞因子也发生明显变化。TNF-α转录水平急剧提升,IFN-α,TGF-β,NF-κΒ和IL-1αm RNA水平也显著升高(p<0.05)。萨佩罗病毒的增殖可以导致IPEC-J2细胞内LOX-1、RIG-I和STAT2基因的m RNA水平显著上调(p<0.01)。功能蛋白LOX-1、STAT2和RIG-I的表达呈现为渐进性变化。STAT2和LOX-1随着病毒的感染和复制呈上调趋势,RIG-I蛋白的表达却呈现为下调。5.捷申病毒感染对IPEC-J2细胞机制的影响捷申病毒导致的IPEC-J2细胞渐进性变化与萨佩罗病毒类似,但也呈现出明显差异。捷申病毒的致细胞病变效应要弱于萨佩罗病毒,引起的细胞凋亡变化过程、细胞周期阻碍效应和细胞骨架重组过程也相应变慢。捷申病毒复制过程中活性氧水平的升高呈现为先逐渐升高,再下降,之后又迅速提升。同时,捷申病毒引起的细胞内炎症细胞因子和功能基因的转录变化要显著弱于萨佩罗病毒,但是功能基因LOX-1,STAT2和RIG-I的蛋白表达水平要高于萨佩罗病毒。6.LOX-1过表达对IPEC-J2细胞机制的影响通过研究LOX-1在IPEC-J2细胞中的功能,我们发现LOX-1在IPEC-J2细胞中的过表达可以诱导细胞的坏死,导致细胞骨架的重组,阻碍细胞周期的变化,促进细胞内NO的生成和活性氧水平的升高。在LOX-1过表达细胞中,炎症相关细胞因子IFN-α,TNF-α,IL-1α和TGF-β的转录水平提高,功能基因RIG-I和STAT2的转录和蛋白表达被上调。将肠道病毒萨佩罗病毒和捷申病毒接种至LOX-1过表达细胞中或将LOX-1与环曲病毒蛋白酶基因共表达,病毒的增殖数量提高,蛋白酶的转录水平也显著升高。综上所述,环曲病毒、萨佩罗病毒和捷申病毒在猪肠道细胞IPEC-J2中复制时,可以提升细胞内氧化应激水平,导致细胞凋亡,诱导细胞骨架重组,阻碍细胞周期变化,同时提高细胞内炎症相关细胞因子和功能基因LOX-1,STAT2和RIG-I的转录水平。不同种属的肠道病毒对IPEC-J2细胞机制的影响呈现一定相似性,也存在着一些差异性。这种相似性和差异性对于我们进一步研究不同肠道病毒的致宿主细胞病理发生发展过程具有重要的参考意义,同时也有利于我们进一步探索肠道病毒共感染在肠道上皮细胞机能变化中的联合作用或颉抗作用。LOX-1基因在IPEC-J2细胞中过表达时,可以引起类似病毒感染的细胞机能变化,并且明显促进环曲病毒、萨佩罗病毒和捷申病毒的复制和增殖。这提示LOX-1在肠道相关病毒致使的肠道炎症病理变化中发挥一定的信号作用。