食管癌是世界上致死率最高的恶性肿瘤之一，超过90%的食管癌都属于鳞状细胞癌。流行病学调查显示各种能引起慢性炎性刺激的因素均可能促进食管鳞状细胞癌的发生。近年来，食管癌的发病率呈逐年增加的趋势，但预后却不容乐观，5年生存率仅20-30%。因此研究其发病机理，寻找早期诊断及治疗的靶标具有非常重要的意义。NF-κB通路对肿瘤的发生发展有着广泛而重要的影响。研究显示NF-κB可以作用于肿瘤细胞影响其生长、凋亡及迁移侵袭等生物学过程，也可作用于肿瘤微环境中的炎性细胞，促进炎性因子的分泌，为肿瘤细胞的生长转移提供合适的环境。然而NF-κB对肿瘤的影响却不尽相同，有时扮演癌基因的角色，有时又发挥抑癌基因的作用，其中的机制至今尚不完全清楚。肿瘤的发生发展是一个多阶段、多因素参与的过程，涉及许多癌基因和抑癌基因的突变，不同类型或不同阶段的肿瘤细胞发生突变的基因也可能不同，NF-κB通路又常常与其他通路（如p53信号通路）发生交互作用来调控下游基因的表达。因此，细胞背景的不同可能会影响NF-κB对下游靶基因的调控从而引起对肿瘤发生发展效应的差异。研究发现食管鳞癌组织中存在NF-κB及下游靶基因的异常表达或活化。小鼠食管鳞癌发生模型中的研究显示食管上皮组织在发生恶性转化的早期已有炎性细胞因子的存在和NF-κB p65的活化，提示NF-κB很可能参与调控食管鳞癌的发生发展过程。由于食管鳞癌也常常发生p53基因的突变，而NF-κB和p53常有相互作用影响彼此对下游靶基因的调控。因此，探讨NF-κB在食管鳞癌发生发展中的作用及对不同食管鳞癌细胞的影响将有非常重要的价值。MicroRNA（miRNA）是近年来发现的一大类调控基因表达的非编码小RNA分子，主要通过与mRNA的3′非翻译区结合影响mRNA的稳定性和蛋白翻译过程。研究表明miRNA在炎症和肿瘤发生等多种病理生理过程中均发挥重要调控作用。目前的研究提示miRNA不仅作为基因表达的调控者调节其他基因的表达，其自身也受到经典的转录因子的调控，已发现miRNA参与多种癌基因或抑癌基因调控网络，包括p53、c-MYC及NF-κB等。然而目前有关NF-κB调控miRNA参与食管鳞癌发生发展的研究还未见报道。因此，本课题的研究目的旨在探讨NF-κB对食管鳞癌发生发展的影响及miRNA在其中的作用和机制。为此，本课题选用两株不同的食管鳞癌细胞—EC109和KYSE450作为实验对象（两株细胞的p53状态不同，EC109中为野生型，KYSE450中为突变型），首先研究NF-κB对不同食管鳞癌细胞生长、凋亡、增殖及周期的影响，进一步通过生物信息学方法和功能筛查的办法寻找食管鳞癌中可能参与NF-κB调控网络的miRNA分子，其中包括miR-34a和miR-330，最后探讨miR-34a和miR-330对食管鳞癌细胞生物学行为的影响及NF-κB对它们的调控和相关机制。本课题的主要研究内容和结果如下：1．NF-κB对不同食管鳞癌细胞的生物学行为影响不同。采用CCK8法、流式细胞术及Edu染色等方法研究NF-κB对食管鳞癌细胞生长、凋亡及增殖等生物学行为的影响。结果发现在EC109细胞中过表达NF-κB p65，可抑制细胞的生长，诱导G1、G2期细胞减少，S期细胞增多，抑制EC109细胞的增殖以及增加细胞凋亡的发生。而在KYSE450细胞中转染p65表达质粒，则有促进细胞生长的作用，对细胞周期的影响主要表现为S期细胞比例增加，对细胞的增殖有轻微的促进作用，而对细胞凋亡无明显影响。此外，采用荧光定量PCR技术还检测了过表达NF-κB p65对食管鳞癌细胞中一些周期和凋亡相关基因的表达改变。结果显示增加p65的表达水平可上调EC109细胞中多种周期素依赖的蛋白激酶抑制因子（CDKI），如p21、p27的表达，以及p53的蛋白水平。同时过表达p65还可降低EC109细胞中抗凋亡蛋白survivin的水平。而在KYSE450细胞中过表达p65除增加p21的蛋白水平，上述其他基因的表达没有明显变化。研究结果提示NF-κB对不同食管鳞癌细胞的生长、增殖和凋亡存在不同的调控，可能与细胞中p53状态的不同有关。2．miR-34a为NF-κB参与食管鳞癌细胞生物学行为调控的靶点。采用CCK8法、PI染色流式细胞检测和transwell实验等方法研究miR-34a对食管鳞癌细胞的生长、周期及迁移侵袭等生物学行为的影响。进一步采用荧光定量PCR、CHIP、EMSA和报告基因技术研究NF-κB对食管鳞癌细胞中miR-34a的表达调控及相关机制。研究发现过表达miR-34a可以诱导食管鳞癌细胞G1期阻滞，抑制细胞的生长，降低细胞的迁移和侵袭能力，提示miR-34a可能有抑制食管鳞癌发生发展的作用。过表达NF-κB p65可以促进食管鳞癌EC109细胞中miR-34a的表达，且这一作用发生在转录调控水平—NF-κB可以与miR-34a基因启动子区的κB位点结合促进基因的转录活性。而在KYSE450细胞中或干扰EC109细胞中p53的表达，NF-κB就不能诱导miR-34a表达，这提示NF-κB对miR-34a的调控需要野生型p53的参与。进一步的研究显示野生型p53对NF-κB诱导miR-34a的转录活性是必须的，但NF-κB与miR-34a的结合并不受p53突变的影响。以上结果提示NF-κB可以在转录水平调控食管鳞癌细胞中miR-34a的表达，但这种调控作用需要野生型p53的参与——p53可能协同NF-κB促进miR-34a的转录活性，但不影响NF-κB与miR-34a的结合。此外，研究还发现NF-κB可能不影响p53对食管鳞癌细胞中miR-34a的调控。3．NF-κB调控miR-330影响食管鳞癌细胞的生物学行为。采用CCK8、PI染色流式细胞仪检测和Edu掺入法检测miR-330对食管鳞癌细胞生长、周期及增殖的影响，进一步采用荧光定量PCR、CHIP和报告基因技术研究NF-κB对食管鳞癌细胞中miR-330的表达调控及相关机制。结果显示增加miR-330的表达，食管鳞癌细胞的生长加快，S期和G2期细胞增多，细胞增殖增加，提示miR-330可能对食管鳞癌的发生发展有促进作用。过表达NF-κB p65后EC109细胞中miR-330的表达明显下调，而KYSE450细胞中的miR-330表达则显著升高。报告基因实验显示在这两种细胞中，NF-κB p65都可以通过miR-330调控区-3117位的κB位点发挥促进转录活性的作用。CHIP实验也表明两株细胞中NF-κB均可以与miR-330调控区结合。研究结果提示miR-330对食管鳞癌细胞的生长有促进的作用。NF-κB可以在转录水平调控食管鳞癌细胞中miR-330的表达，但在不同的细胞中调控效应不一致，具体机制有待进一步研究。综上所述，本课题的研究结果提示NF-κB对不同背景的食管鳞癌细胞的生物学特性有不同的影响，p53状态的不同可能为其中的一个影响因素。MiR-34a和miR-330为食管鳞癌中NF-κB调控网络中的两个新成员，而在不同食管鳞癌细胞中NF-κB对它们的差异调控可能是导致NF-κB对不同食管鳞癌细胞生物学特性调控不同的原因之一。细胞中p53状态的不同是导致NF-κB差异调控miR-34a的原因，而NF-κB对miR-330不同调控的机制还有待进一步的研究。本课题初步揭示了NF-κB在食管鳞癌细胞生物学行为调控中的复杂作用及通过对下游miRNA分子的差异调控产生不同的作用效应。本研究有助于深入认识食管鳞癌发生发展的机制并为食管鳞癌的诊治提供依据。