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肾癌是最常见的肾实质恶性肿瘤，且发病率正在升高。肾癌生物学行为极为复杂，对放疗和化疗均不敏感，目前临床上对于手术后患者和转移性肾癌患者主要进行免疫治疗。但常用的白介素-2(IL-2)和干扰素-α(IFN-α)单药治疗的抗肿瘤活性一般，疾病缓解大多不能持久，另外大剂量IL-2的毒性相当大，许多受试者不适合这种治疗。低氧诱导因子HIF能增强其下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖转录因子—1(GLUT1)和糖酵解酶等基因的表达，促进血管的生成和细胞能量代谢，其过度表达在恶性肿瘤的发生发展过程中可能扮演着重要的角色。本课题首先应用RT-PCR和Western-Blot方法检测肾细胞癌组织和人肾癌细胞株786-0以及OS-RC-2中缺氧诱导因子HIF1-α和HIF2-α在基因转录水平和蛋白质水平上的表达情况，探讨了HIF1-α和HIF2-α与肾细胞癌发生发展过程的相关性。进一步构建了能够稳定表达HIF1-α和HIF2-α基因的真核质粒，并转染入人肾癌细胞株786-0以及OS-RC-2中。采用化学合成法设计合成小干扰RNA(siRNA)，对转染入细胞株中的HIF基因进行RNA干扰，明确合成的siRNA在基因和蛋白水平均能够有效抑制HIF的表达。在此基础上，通过MTT方法检测其对肿瘤细胞增殖的影响，免疫组化方法研究其对HIF下游基因VEGF等的影响。然后将裸鼠接种肾癌细胞和RNA干扰后的肾癌细胞，了解HIF基因对于致瘤性的影响。本课题采用RNA干扰方法研究缺氧诱导因子HIF1-α和HIF2-α对肾癌细胞增殖和肿瘤生长的影响，为肾细胞癌的基因治疗提供了一定的实验依据。第一部分HIF-1α和HIF-2α在肾细胞癌中的表达及意义目的：探讨低氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α在肾透明细胞癌组织和人肾癌细胞786-0和OS-RC-2中的表达及其临床意义。方法：应用RT-PCR的方法从转录水平检测了56例原发性散发肾细胞癌和52例正常肾组织中HIF-1αmRNA及HIF-2αmRNA的表达情况，应用Western-Blot方法从蛋白质水平检测了HIF-1α和HIF-2α的表达情况。同时对人肾癌细胞786-0以及OS-RC-2中HIF-1α和HIF-2α在转录和蛋白水平的表达情况进行了检测。结果：HIF-1αmRNA在肾透明细胞癌标本组织中的表达率为87.5％，较对照组织中增高，差异有统计学意义(P＜0.001)；HIF-2αmRNA在肾透明细胞癌标本组织中的表达率为94.6％，较对照组织中增高，差异有统计学意义(P＜0.001)。56例RCC组织标本中52例表达HIF-1α蛋白，阳性率为92.9％，较对照组织中增高，差异有统计学意义(P＜0.001)。56例RCC组织标本中54例表达HIF-2α蛋白，阳性率为96.4％，较对照组织中增高，差异有统计学意义(X~2=88.59，P＜0.001)。人肾细胞癌细胞株786-0和OS-RC-2中HIF-1αmRNA、HIF-2αmRNA及蛋白均阳性表达。结论：HIF-1α和HIF-2α在mRNA和蛋白水平的表达可能对肾透明细胞癌的发生和发展有重要作用。第二部分HIF干扰表达载体psilencer3.0-HIF-αsiRNA的构建和鉴定目的：构建psilencer3.0-HIF-αsiRNA重组质粒，为探讨HIF-1和HIF-2的功能奠定基础。方法：设计并化学合成可以抑制HIF-1α和HIF-2α的siRNA，通过细胞转染的方法将其构建进RNAi表达载体。采用实时定量PCR和Western blot检测构建成功的RNAi表达载体在mRNA及蛋白水平对目标基因表达的抑制。结果：转染4种重组质粒的细胞HIF-1αmRNA相对表达量均小于1，其中psilencer3.0-HIF-1αsiRNA2和psilencer3.0-HIF-1αsiRNA3的干扰效应尤为明显，在转染48h后的786-0细胞中，抑制率分别达到了75.4％、82.1％；在OS-RC-2细胞中，抑制率则达到了82.3％和91.2％。转染4种重组质粒的细胞HIF-2αmRNA相对表达量均小于1，其中psilencer3.0-HIF-2αsiRNA1和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA3的干扰效应尤为明显，在转染48h后的786-0细胞中，抑制率分别达到了76.1％，87.4％；在OS-RC-2细胞中，抑制率则达到了72.3％和81.2％。在转染的786-0细胞中转染4种HIF-1α干扰质粒的实验组蛋白表达量较空白对照均有不同程度的减低，其中psilencer3.0-HIF-1αsiRNA2和psilencer3.0-HIF-1αsiRNA3组的蛋白表达水平相对最低；在OS-RC-2细胞中，转染psilencer3.0-HIF-1αsiRNA2和psilencer3.0-HIF-1αsiRNA3组的HIF-1α蛋白降低水平更加明显。在转染的786-0细胞中转染4种HIF-2α干扰质粒的实验组蛋白表达量较空白对照均有不同程度的减低，其中psilencer3.0-HIF-2αsiRNA1和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA3组的蛋白表达水平相对最低；在OS-RC-2细胞中，转染psilencer3.0-HIF-2αsiRNA1和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA3组的HIF-1α蛋白降低水平更加明显。结论：构建成功的RNAi表达载体可以有效抑制目标基因HIF-1和HIF-2在mRNA及蛋白水平的表达。第三部分HIF-1α和HIF-2α对人肾癌细胞增殖的影响目的：研究成功构建的HIF-α的RNAi表达质粒psilencer3.0-HIF-1αsiRNA和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA对肾癌细胞增殖的影响，及其对HIF下游基因VEGF等的影响。方法：通过MTT方法检测psilencer3.0-HIF-1αsiRNA和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA对肿瘤细胞增殖的影响，免疫组化方法研究其对HIF下游基因VEGF等的影响。结果：Rpsilencer3.0-HIF-αsiRNA可以抑制786-0细胞的体外增殖。psilencer3.0-HIF-1αsiRNA质粒组的相对抑制率为47.4±4.3％，psilencer3.0-HIF-2αsiRNA质粒组的相对抑制率为52.7±5.8％，与空白对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)，与转染空载体组比较差异同样具有显著性(P＜0.05)。Rpsilencer3.0-HIF-αsiRNA可以抑制OS-RC-2细胞的体外增殖。psilencer3.0-HIF-1αsiRNA质粒组的相对抑制率为55.3±5.6％，psilencer3.0-HIF-2αsiRNA质粒组的相对抑制率为44.3±4.1％，与空白对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)，与转染空载体组比较差异同样具有显著性，(P＜0.05)。对HIF-1α和／HIF-2α进行RNA干扰后，肾癌细胞中下游基因VEGF的表达明显低于未干扰组。结论：RNAi表达载体psilencer3.0-HIF-1αsiRNA和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA能够抑制人肾细胞癌的增殖，下调其下游基因VEGF的表达。第四部分HIF-1α和HIF-2α对人肾癌细胞致瘤性的影响目的：探讨HIF-1α和HIF-2α对人肾癌细胞致瘤性的影响。方法：把40只裸鼠随机分成空白对照组、psilencer3.0-HIF-1αsiRNA、psilencer3.0-HIF-2αsiRNA和空载体组4组。接种后每3天观察肿瘤，并用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)、最短径(b)，并按公式计算肿瘤体积。于接种6周后处死裸鼠，剥离取出肿瘤称重，计算瘤重抑瘤率。结果：psilencer3.0-HIF-1αsiRNA和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA组肿瘤的体积较同期的空白对照组和空载体组肿瘤明显小(P＜0.05)；psilencer3.0-HIF-2αsiRNA组肿瘤的体积虽然较同期的psilencer3.0-HIF-1αsiRNA组稍小，但无明显差异(P＞0.05)。psilencer3.0-HIF-1αsiRNA和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA组肿瘤的重量较对照组肿瘤明显轻(P＜0.05)；psilencer3.0-HIF-2αsiRNA组肿瘤的重量虽然较同期的psilencer3.0-HIF-1αsiRNA组稍轻，但无明显差异(P＞0.05)。结论：转染psilencer3.0-HIF-1αsiRNA和psilencer3.0-HIF-2αsiRNA后能明显抑制肾癌的形成和生长，从而证实HIF-1α和HIF-2α在肾癌的发生发展过程中发挥着重要的作用。