胶原是结缔组织中主要的细胞外蛋白,占脊椎动物总蛋白的30%。角膜中V型胶原含量高于其他组织,是V型胶原提取的绝佳材料。不同类型的胶原具有不同的生物活性,例如蛋白质-蛋白质相互作用、细胞行为调节和组织特性。此外,V型胶原与许多疾病相关(例如,经典的Ehlers-Danlos综合征、肺纤维化,以及心肌梗塞（MI）。因此,高纯度的V型胶原用于科学研究和准确的V型胶原定量方法在科学研究、疾病诊断和治疗以及工业提取中尤为重要。本文研究的目的是开发一种基于超滤技术制备高纯度V型胶原的方法和探究V型胶原与成纤维细胞（L929）相互作用。已经报道了许多提取V型胶原的方法,但没有提供胶原的纯度,没有详细描述V型胶原的结构和生理功能。以酸酶法和膜分离相结合的方法提取的胶原为实验原料,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、傅立叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）等进行表征。结果表明,样品总胶原含量为91.27±1.34%,本方法提取的V型胶原纯度为85.67±9.46%,高于对照组的38.99±4.66%。SDS-PAGE表明,角膜中的V型胶原的组成为[α1（Ⅴ）]2[α2（Ⅴ）],分子量为440k Da。FTIR表明,提取的V型胶原符合胶原的特征吸收。CD光谱表明,提取的V型胶原具有完整的三螺旋结构。DSC表明,V型胶原的热变性温度为43.48℃,高于I型胶原的42.15℃。SEM表明I型胶原形成了直径相对较大的原纤维（平均直径70.04±19.96 nm）。V型胶原形成了更细的原纤维（平均直径50.67±5.63 nm）。随着V型胶原添加量的增加,I型胶原纤维的直径先增大后减小。当V型胶原含量为10%时,I型胶原纤维直径最大为88.75±11.83nm。TEM表明I型胶原形成了典型的61.42±4.98 nm D周期,而原生V型胶原形成了相当薄的原纤维,没有明显的周期性。随着V型胶原添加量的增加,I型胶原D周期没有观察到变化。其次,建立了一种基于高效液相色谱与质谱联用（HPLC-MS）的特征多肽外标定量牛V型胶原的方法。采用酸酶水解法提取的V型胶原,LCQ质谱筛选出V型胶原的特征多肽为GPAGPMGLTGR。方法具有宽线性范围（0.01-5.00μg/m L）,相关系数为0.9984,检测限和定量下限分别为3.00×10-3μg/m L和6.25×10-3μg/m L,方法精密度为1.49%,加标回收率为97.1%-109.6%,相对标准偏差（RSD）小于5%。该方法成功应用于牛心脏、肺和角膜中V型胶原含量的测定,分别为0.72±0.01%、0.23±0.01%、2.89±0.00%。结果表明,与酶联免疫吸附试验（ELISA）相比,所提出的方法更适合测量组织样品中V型胶原的含量。特征多肽法准确度高、重现性好,将为V型胶原的提取和应用奠定基础。最后,探究了I型和V型胶原对成纤维细胞（L929）增殖、迁移、形态的影响。细胞增殖表明,随着I型胶原浓度的增加,L929的生长没有明显的抑制作用,而随着V浓度的增加,L929的生长受到显着抑制。V型胶原加入量为10%-70%时,细胞增殖无显着差异。当V型胶原添加量为100%时,细胞增殖显着下降。细胞迁移表明,添加0-20%V型胶原时细胞迁移率无显着差异,添加30%V型胶原时细胞迁移率显著提高并达到最高。虽然当添加的V型胶原在30-100%的范围内时细胞迁移受到轻微抑制,但显示添加V型胶原可促进细胞迁移。细胞形态表明,当V型胶原的添加量为0-70%时,未观察到细胞核大小的显着变化。当V型胶原的比例达到100%时,细胞收缩和形态变圆。