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背景:近年来,得益于各种先进制造技术的应用以及“无细胞支架”的深入研究,各类生物材料在骨组织工程领域迅速发展,通过脱细胞法得到的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）是研究热点之一。ECM中含有多种组织特异性的胶原结构,脱细胞ECM具备良好的物理及生物特征,可以制成凝胶、支架等形式,也可制成生物墨水用于3D打印。应用于骨组织工程生物材料的要求包括良好的细胞相容性,利于细胞早期黏附、增殖及促进细胞成骨分化。研究表明,骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）来源的脱细胞ECM能够促进牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells,PDLSCs）成骨分化,促进牙槽骨缺损修复。因此,制备优化的脱细胞ECM以提高其促成骨性能,成为脱细胞ECM作为生物材料应用于骨组织工程的研究方向。目的:本研究旨在探讨成骨诱导脱细胞ECM对PDLSCs黏附、增殖和成骨分化的影响,为临床有效利用PDLSCs治疗骨缺损提供重要的理论和实验依据。1.使用抗坏血酸和成骨培养基诱导两种BMMSCs来源ECM,采用化学脱细胞法脱细胞,制备抗坏血酸诱导BMMSCs来源的脱细胞ECM（Bone marrow mesenchymal stem cells derived decellularized extracellular matrix,BECM）和成骨诱导BMMSCs来源的脱细胞ECM（Osteogenic bone marrow mesenchymal stem cells derived decellularized extracellular matrix,OBECM）。2.探究BECM和OBECM对PDLSCs黏附和增殖的影响,评估两种脱细胞ECM促PDLSCs的成骨分化的影响。方法:1.复苏培养人BMMSCs,采用含抗坏血酸的培养基诱导10天形成细胞膜片,使用含1%Triton X-100和20 mMNH4OH的PBS进行脱细胞,制备得到BECM。采用成骨诱导培养基诱导10天后,使用同样化学法脱细胞,制备得到OBECM。2.实验分三组:聚苯乙烯（Tissue culture polystyrene,TCP）作为空白对照组、BECM组、OBECM组。3.脱细胞ECM的检测:DAPI染色确认脱细胞结果;扫描电镜（Scanning electron microscopy,SEM）观察ECM和脱细胞ECM的表面结构;BCA法（BCA Protein Assay Kit）测定BECM和OBECM蛋白含量。4.早期黏附和增殖能力检测:PDLSCs以5×104/孔细胞密度铺板24孔板,分别接种于TCP、BECM和OBECM组;鬼笔环肽（F-actin Staining,Green）染色观察PDLSCs 0.5、4、8、24 h早期黏附情况;活死染色检测PDLSCs接种于TCP和BECM组24 h的存活率,验证脱细胞ECM的生物安全性;CCK-8验证1、3、5、7天PDLSCs的增殖能力;Ki67免疫荧光染色验证1、3、5、7天PDLSCs的增殖速率。5.成骨分化能力检测:PDLSCs以2×105/孔密度接种于6孔板,TCP、BECM、OBECM三组;成骨诱导分化培养1、3、7、14天,采用碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）染色验证其成骨能力;成骨诱导培养21天,采用茜素红（Alizarin Red S,ARS）染色检测矿化结节情况;最后采用Western Blot检测成骨诱导7天成骨相关蛋白骨桥蛋白（Osteoponin,OPN）和ALP的表达。结果:1.DAPI染色结果显示脱细胞后,无蓝染核颗粒出现,证明脱细胞完全。BCA结果表明OBECM蛋白含量高于BECM,但无统计学差异（P＞0.05）;SEM结果显示,两种脱细胞ECM表面都有大量纤维结构存在,其中制备的OBECM相较BECM纤维更粗大,另外OBECM表面有更多矿化沉淀状结构;2.鬼笔环肽染色观察早期黏附情况,结果表明PDLSCs在两种脱细胞ECM上伸展良好,脱细胞ECM利于PDLSCs早期黏附;活死实验结果显示,使用化学脱细胞法以及灭菌后制备的脱细胞ECM生物安全性良好;CCK-8统计结果表明,BECM和OBECM促进PDLSCs增殖能力（P＜0.001）,同时Ki67染色显示在第1、3天,PDLSCs于BECM、OBECM上增殖速率明显提高（P＜0.05）。3.ALP染色结果表明,随成骨分化时间增加,PDLSCs于BECM和OBECM上成骨分化都优于TCP组。21天ARS染色结果显示,OBECM和BECM组矿化结节更多,面积更大（P＜0.05）。WB结果表明,与TCP组相比,BECM和OBECM组表达更多ALP成骨蛋白（P＜0.05）,并且OBECM组比BECM组表达更多（P＜0.05）;相比TCP组,OBECM组OPN蛋白含量表达更多（P＜0.001）。结论:1.成功制备抗坏血酸和成骨诱导的两种BMMSCs脱细胞ECM:BECM 和 OBECM。2.与TCP组相比,BECM和OBECM均可促进PDLSCs早期黏附和增殖能力。3.与TCP组相比,BECM和OBECM均可促进PDLSCs成骨分化能力,OBECM促成骨性能较强。