结核分枝杆菌感染机体后主要激活CD4+T细胞和CD8+T细胞,CD4+T细胞分化为Th1型细胞,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子,激活巨噬细胞等细胞免疫应答,CD8+T细胞分化为CTL细胞直接杀伤靶细胞,发挥清除结核分枝杆菌的作用。然而耐药结核、痰菌阳性的纤维空洞型肺结核等重症结核病患者体内结核分枝杆菌长期慢性感染会导致机体免疫功能低下。我们实验室前期应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染的状态,发现结核分枝杆菌抗原持续刺激会导致T细胞耗竭,表现为T细胞受特异性抗原刺激后增殖能力下降、产生细胞因子IFN-γ和IL-2减少。在该结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的动物模型上,进一步对T细胞耗竭进行治疗研究,发现给予IL-2干预可逆转其耗竭状态。在上述研究基础上,我们进而拟研究抗原持续刺激导致T细胞耗竭过程中骨髓造血功能的变化。维持骨髓造血干细胞（HSC）及前体细胞稳态是机体维持正常造血功能及建立有效抗结核免疫应答的基础。骨髓HSC的分化增殖受GM-CSF、IL-2、IFN-γ等细胞因子的调节。研究发现淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）等病毒及细菌感染过程中,细胞因子IFN-γ持续分泌,可引起造血功能障碍。重症结核病出现免疫耗竭及骨髓造血功能障碍的研究较少,相关机制尚不清楚。目的:我们推测结核分枝杆菌抗原持续刺激情况下,刺激产生的细胞因子持续作用于骨髓,造成骨髓HSC及造血前体细胞功能异常。本实验继续应用前期我们实验室建立的结核分枝杆菌抗原持续刺激引起T细胞耗竭的动物模型,研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血功能的影响。方法:为了研究结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血及T细胞免疫功能的影响,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激小鼠,观察结核分枝杆菌抗原持续刺激过程中骨髓造血细胞增殖能力的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价结核抗原刺激诱导的免疫应答对骨髓造血功能的影响。在此基础上进一步研究IL-2治疗对骨髓造血功能的影响。（1）抗原刺激及IL-2治疗程序。考虑到生物安全等因素,本课题应用结核分枝杆菌抗原持续刺激模拟临床结核分枝杆菌持续感染对免疫系统和骨髓造血功能的影响。本研究首先用卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin,BCG）免疫C57BL/6小鼠,然后用结核分枝杆菌抗原ESAT-6、CFP-10联合融合蛋白Mtb10.4-HspX（MH）与佐剂DDA和Poly（I:C）持续刺激,每周一次,反复皮下注射。抗原反复刺激12周后检测到骨髓造血细胞（Lin-c-Kit+,LK细胞）增殖能力降低,抗原刺激22次后检测到明显的T细胞功能障碍。采用IL-2对T细胞及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗,研究IL-2治疗后骨髓造血细胞增殖及分化能力的改变。研究中,我们设立蛋白抗原强化免疫2次作为抗原短暂刺激组对照。同时设立佐剂对照组排除佐剂对T细胞及造血细胞功能的影响。（2）T细胞功能分析。通过流式细胞术、细胞因子胞内染色法检测脾脏CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ的水平;应用MHC Ⅰ类分子-抗原表位肽五聚体染色技术检测TB 10.4 4-12特异性的记忆性CD8+T细胞的数量。（3）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞,应用EdU增殖试验检测造血细胞的增殖能力;用ELISA方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ和IL-2的水平;磁珠分选造血细胞,并应用实时荧光定量RT-PCR检测造血细胞分化相关转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析抗原刺激对造血细胞分化的影响。（4）IL-2对骨髓造血细胞的治疗作用及机制分析。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）结核分枝杆菌抗原持续刺激对T细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,对细胞因子的检测发现,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周时,脾脏CD4+T细胞受特异性抗原刺激分泌较高水平的IFN-γ（p<0.05）,但IFN-γ在持续抗原刺激22周后下降;应用MHC抗原表位肽五聚体技术检测发现持续抗原刺激12～22周,脾脏中TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量相比抗原短暂刺激组明显减少（p<0.01）。（2）结核分枝杆菌抗原持续刺激对造血细胞功能的影响。应用结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激小鼠,抗原持续刺激12周时,骨髓造血微环境中IFN-γ的水平明显升高（p<0.05）,但IFN-γ在抗原持续刺激后期下降。EdU增殖试验表明,与抗原短暂刺激组相比,抗原持续刺激12周及22周后LK细胞的增殖能力降低（p<0.05）。骨髓c-Kit+的细胞群中转录因子的表达水平与佐剂对照组相比也发生了明显变化:决定髓系分化的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而促进淋巴系细胞分化的转录因子NOTCH1表达下调。（3）IL-2的治疗作用。在给予小鼠结核分枝杆菌蛋白抗原持续刺激的同时,我们应用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,骨髓造血微环境中IL-2的水平升高。相比抗原持续刺激组,IL-2处理可下调Batf2和IRF8的表达,上调GATA2和NOTCH1的表达,LK细胞的增殖能力回升（p<0.05）。同时,T细胞耗竭也得到逆转:CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平升高（p<0.05）,脾脏TB10.4 4-12特异性记忆性CD8+T细胞的数量显著增加（p<0.05）。（4）JAK3-STAT5信号通路的研究。JAK3-STAT5信号转导通路对造血细胞分化增殖起调控作用。相比佐剂组,抗原持续刺激组中JAK3和STAT5 mRNA表达水平较低。IL-2治疗后,JAK3和STAT5表达明显增强。结论:结核分枝杆菌抗原刺激诱导IFN-γ分泌为主的Th1型免疫应答。结核分枝杆菌抗原持续刺激诱导IFN-γ水平在一定时间内增高造成骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达;补充IL-2可增强LK细胞的增殖能力,上调淋巴系分化相关转录因子GATA2、NOTCH1的表达,维持骨髓造血的稳态。此外,IL-2上调JAK3和STAT5的表达,推测IL-2也通过上调JAK3-STAT5途径分子表达调节造血细胞的增殖分化。因此,结核分枝杆菌抗原持续刺激会影响造血作用,导致造血细胞增殖能力降低,髓系分化相关的转录因子表达增高,而IL-2治疗可维持骨髓造血的稳态。本实验首次研究了结核分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血细胞发育分化的影响,揭示了结核分枝杆菌持续感染状态下结核病患者免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为进一步研究重症肺结核的精准诊治提供了思路。粟粒性肺结核是由于大量结核分枝杆菌在短时间内进入血液循环所引起的急性全身血行播散型结核病。其病情急且凶险、病死率较高。粟粒性肺结核患者由于体内结核分枝杆菌大量感染会导致机体造血功能障碍和免疫功能低下,但相关机制尚不清楚。目的:我们推测粟粒性肺结核是由大量结核分枝杆菌入血后,诱发T细胞过强的免疫反应,产生的细胞因子进一步作用于骨髓造血细胞,影响骨髓造血细胞的发育分化,淋巴细胞生成减少,最终引起机体免疫功能降低。为验证上述假设,本实验应用卡介苗（BCG）入血感染模拟临床粟粒性肺结核感染的免疫病理变化,研究其对骨髓造血系统和免疫系统的影响。方法:首先,调取临床粟粒性肺结核患者的病例资料,分析研究粟粒性肺结核临床病例外周血血细胞数量变化,研究骨髓造血功能的变化特点;其次,应用不同剂量BCG经尾静脉注射或滴鼻的方式感染小鼠,观察T细胞功能和骨髓造血功能的变化,并分析与造血细胞分化相关转录因子表达水平的改变,评价BCG感染对骨髓造血功能的影响和免疫应答特点,建立应用BCG感染模拟粟粒性结核造血功能受损的动物模型。（1）临床病例资料分析。分析2015年至2019年兰州市肺科医院收治入院的肺结核病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。通过回顾性分析,研究粟粒性肺结核患者外周血血细胞数量变化。（2）BCG感染及IL-2治疗程序。根据文献报道及考虑到生物安全等因素,本课题应用大剂量BCG替代结核分枝杆菌感染小鼠来模拟临床粟粒性肺结核感染,首先用大剂量BCG（5×107 CFU/ml）分别以尾静脉注射和滴鼻的方式感染小鼠,分别于感染后3周、5周和8周,检测外周血血细胞数量、T细胞功能和骨髓造血细胞（LK细胞）增殖分化能力。研究中,设立低剂量BCG（5×105 CFU/ml）滴鼻感染小鼠作为对照,同时设PBS对照组排除外界因素和年龄对T细胞和骨髓造血细胞功能的影响。（3）外周血细胞数量、血清IFN-γ的水平和脏器指数的变化。将新鲜采集的小鼠血液加入抗凝管中,通过动物血液分析仪检测不同组血细胞数量的变化。未抗凝的外周血凝固后离心收集血清,用ELISA检测血清中IFN-γ的水平;通过称量脾脏、肝脏、肺脏及小鼠重量,观察BCG感染对脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数的影响。（4）T细胞功能分析。通过ELISA检测脾脏淋巴细胞受BCG蛋白纯化衍生物（PPD）刺激后分泌IFN-γ和IL-2的水平;应用流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞表面表达抑制性受体PD-1的水平;应用EdU增殖试验检测脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞受PPD刺激后的增殖能力。（5）骨髓造血细胞的功能分析。无菌分离骨髓细胞并对其进行磁珠分选,得到LK细胞,用EdU增殖试验检测LK细胞的增殖能力;用ELISA的方法检测骨髓造血微环境中IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和GM-CSF的水平;提取LK细胞的总RNA,并应用实时荧光定量RT-PCR检测LK细胞中转录因子Batf2、IRF8、GATA2和NOTCH1的表达水平,分析BC G感染对LK细胞分化的影响。（6）IL-2治疗作用分析。在大剂量BCG入血感染后,应用IL-2对发生T细胞耗竭及骨髓造血细胞增殖分化异常的小鼠进行干预治疗。IL-2干预后,检测上述指标的变化,分析IL-2的治疗效果及机制。结果:（1）临床病例资料分析。我们回顾性分析了 2015年至2019年兰州市肺科医院收治的结核病病例28,047例,其中粟粒性肺结核病例共118例。根据患者外周血血细胞检测结果分析患者各类血细胞变化,发现118例粟粒性肺结核患者中89%发生淋巴细胞减少（105例）、23%发生白细胞减少（27例）、8.5%发生中性粒细胞减少（10例）、49.2%发生血红蛋白减少（58例）、11%发生红细胞减少（13例）、8.5%发生血小板减少（10例）、全血细胞减少6例,占4.2%。以上数据表明粟粒性肺结核常继发淋巴细胞减少,其次可继发白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等各类血细胞减少症。（2）BCG感染对外周血血细胞数量和脏器指数的影响。在BCG感染后5周,与PBS组相比,大剂量BCG尾静脉注射组小鼠外周血白细胞、淋巴细胞和血小板减少,小鼠脾脏指数、肝脏指数和肺脏指数明显升高,提示脾脏、肝脏和肺脏明显肿大。（3）BCG感染对T细胞功能的影响。在BCG感染后3周、5周和8周,与PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组相比,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞明显高表达抑制性受体PD-1（p<0.05）。EdU增殖试验表明:低剂量BCG滴鼻组脾脏CD8+T细胞增殖能力明显强于其他组;相对于PBS组、低剂量BCG滴鼻组和高剂量BCG滴鼻组,高剂量BCG尾静脉注射组脾脏CD8+T细胞的增殖能力明显降低（p<0.05）。ELISA检测脾脏淋巴细胞受特异性抗原PPD刺激分泌IFN-γ和IL-2的水平,结果如下:在3-5周时高剂量BCG尾静脉注射组较低剂量BCG滴鼻组及PBS组产生较高水平的IFN-γ（p<0.05）,8周后产生IFN-γ的能力明显降低;在感染3-5周低剂量BCG感染组产生IL-2的水平高于PBS组和高剂量BCG尾静脉注射组（p<0.05）。（4）BCG感染对骨髓造血细胞功能的影响。在BCG感染后3周,高剂量BCG尾静脉注射组LK细胞增殖能力明显高于PBS组（p<0.01）,随后逐渐降低。骨髓上清液中细胞因子的变化如下:在BCG感染后5周,相比PBS组,高剂量BCG尾静脉注射组产生较高水平的IFN-γ和TNF-α（p<0.05）,IL-2、IL-6和GM-CSF的水平无明显变化,但低剂量BCG滴鼻组IL-2、IL-6和GM-CSF明显增高（p<0.05）。高剂量BCG尾静脉注射组骨髓LK细胞群中转录因子的表达水平与PBS对照组相比也发生了明显变化:髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8表达上调,而淋巴系分化相关的转录因子GATA2和NOTCH1表达下调。（5）IL-2的治疗作用。在大剂量BCG入血感染小鼠后,用IL-2进行干预治疗。结果发现,IL-2干预后,T细胞耗竭得以逆转。结论:回顾性分析临床粟粒性肺结核患者的病例资料,结果发现粟粒性肺结核患者会出现淋巴细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等造血功能受损表现,和文献报道一致。应用小鼠模型研究发现,大剂量BCG入血感染可致外周血淋巴细胞和血小板减少,诱导骨髓造血微环境中细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平增高,导致骨髓LK细胞增殖能力降低,并上调髓系分化相关的转录因子Batf2和IRF8的表达,下调淋巴系分化相关转录因子GATA2和NOTCH1的表达,最终导致T细胞耗竭。补充IL-2后T细胞耗竭有所逆转。本研究结合临床病例资料和动物实验研究,从骨髓造血细胞发育分化的角度揭示粟粒性肺结核免疫功能低下的机制及骨髓造血功能的改变,为粟粒性肺结核防治提供了参考。T细胞发育分化过程需要糖酵解和氧化磷酸化提供能量,尤其是效应T细胞的糖酵解代谢更为活跃。上一章研究我们发现大剂量BCG入血感染会使T细胞过度活化,导致T细胞耗竭的发生。我们推测抑制糖酵解,减轻T细胞的活化,有可能阻断T细胞耗竭的发生。糖酵解也是肿瘤代谢的重要特征。我们实验室前期通过蛋白质组学筛选到宫颈癌组织高表达糖酵解酶烯醇化酶1（ENO1）。用ShRNA干扰沉默ENO1基因的表达可明显降低宫颈癌Hela和SiHa细胞的成瘤能力及侵袭转移能力,说明抑制ENO1表达可以阻断糖酵解,从而起到治疗肿瘤的作用。目的:虽然应用shRNA干扰ENO1表达可抑制肿瘤生长,但RNA干扰技术受到病毒载体和运输系统的限制。为了促进临床应用,本课题拟制备ENO1的单克隆抗体,进一步研究其抗肿瘤作用。此外,前两章的研究发现结核分枝杆菌抗原持续刺激和大剂量BCG入血感染会导致T细胞功能低下甚至耗竭,如何扭转耗竭对于结核病防治有重要意义。细胞代谢变化可决定T细胞功能,因而细胞代谢被认为是T细胞功能和分化的关键调节因子。本研究制备ENO1的单克隆抗体,后期将进一步通过干预T细胞代谢,研究治疗T细胞耗竭的新方法和策略。方法:本课题拟用真核表达系统表达ENO1蛋白,纯化ENO1蛋白,制备ENO1单克隆抗体。预期ENO1的单克隆抗体通过干扰肿瘤细胞表面ENO1可以降低肿瘤细胞迁移侵袭能力。我们筛选有较强抗宫颈癌SiHa细胞迁移侵袭能力的ENO1单克隆抗体。对编码ENO1单克隆抗体的基因进行测序,将其可变区基因序列重组构建在腺相关病毒上。后续我们将对腺相关病毒表达抗体可变区蛋白多肽的功能进行鉴定,对ENO1单克隆抗体对糖酵解的抑制作用展开深入研究。（1）ENO1的克隆、表达和纯化方案一:以pET30a-ENO1质粒为模板,将ENO1基因克隆入真核表达载体pcDNA中,构建重组质粒pcDNA3.1-ENO1,并将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转入人胚肾细胞（HEK-293T细胞）中,表达出ENO1蛋白,并用Ni-NTA介质进行纯化。方案二:将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1细胞）中,表达和纯化ENO1蛋白。方案三:将ENO1基因克隆入杆状病毒表达载体pFastBac1中,转入昆虫细胞Sf9中,表达和纯化ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体的制备。用ENO1蛋白反复免疫BALB/c小鼠,取出抗体滴度较高的小鼠脾脏细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。对阳性杂交瘤细胞进行反复筛选,获得效价较高的杂交瘤细胞株,诱导腹水产生,纯化得到ENO1单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体的抗肿瘤作用评价。采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力的影响,筛选出效果最佳的ENO1单克隆抗体。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。分别提取五株杂交瘤细胞的RNA,通过RT-PCR获得相应的cDNA。基于抗体重链和轻链恒定区的已知序列设计3’-末端基因特异性引物,联合5’-末端的通用引物用于cDNA基因的PCR扩增,通过对扩增产物进行测序,获得ENO1单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。选择对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1的轻链和重链可变区基因,中间用Linker--（GGGGS）3连接,克隆在pAAV-MCS载体上,由公司合成,简称rAAV-H1。对AAV辅助病毒系统中的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1菌液进行复苏、保种和扩增,并大量抽提质粒,将其转染入AAV-293细胞中,观察其转染效率、收集病毒并进行滴度测定。同时,将带有绿色荧光蛋白的pAAV-IRES-ZsGreen1转入AAV293细胞中,作为空载体对照（rAAV-GFP）。结果:（1）ENO1蛋白表达与纯化。首先将pcDNA3.1-ENO1以瞬时转染的方式成功转染入HEK-293T细胞中,表达纯化ENO1蛋白,但蛋白得率太低;将pcDNA3.1-ENO1以稳定转染的方式成功转染入CHO-K1细胞中,表达纯化目的蛋白,同样蛋白得率太低;最后将ENO1基因克隆入pFastBac1中,转入Sf9细胞中,蛋白表达量高,纯化出高纯度的ENO1蛋白。（2）ENO1单克隆抗体制备。ENO1蛋白免疫小鼠后,通过杂交瘤技术成功筛选到5株效价较高的阳性杂交瘤细胞株,纯化获得相应的单克隆抗体。（3）ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞迁移、侵袭作用的影响。应用细胞划痕实验和Transwell小室实验,初步评价5个ENO1单克隆抗体的抗肿瘤细胞迁移、侵袭作用。检测结果示五个ENO1单克隆抗体对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力均有抑制作用,其中H1的抑制作用最强。（4）ENO1单克隆抗体可变区基因测序。在得到单克隆抗体的基础上,利用通用引物从杂交瘤细胞的RNA钓取抗体的重链和轻链可变区基因,对获得的抗体可变区基因进行测序,成功获得可变区基因序列。（5）腺相关病毒包装ENO1抗体的可变区基因。将得到的ENO1抗体重链和轻链可变区基因构建在腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。大量抽提得到浓度较高的pHelper、pAAV-RC和rAAV-H1质粒,将其转染入AAV293细胞中,结果示转染成功,且转染效率达到90%。结论:应用杆状病毒表达载体,成功表达和纯化出高纯度的ENO1蛋白;应用ENO1蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤技术成功制备和筛选到5个高效价的ENO1单克隆抗体;通过ENO1单克隆抗体对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力的抑制作用评价,筛选出有明显抑制效果的ENO1单克隆抗体H1;成功获得ENO1单克隆抗体的可变区基因序列。将ENO1抗体的可变区基因重组到腺相关病毒载体上,得到rAAV-H1。ENO1单克隆抗体的制备和相关研究为下一步研究ENO1单克隆抗体抑制糖酵解抗肿瘤和T细胞耗竭作用奠定了基础。