致病性大肠杆菌可以分为肠道内致病性大肠杆菌(intestinal pathogenicEscherichia coli)和肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic E.coli,ExPEC)两类。禽致病性大肠杆菌(avian pathogenicEscherichia coli,APEC)属于ExPEC中的一种,可以通过呼吸道途径感染禽类从而引起多系统损伤综合征。该病给养禽业造成了巨大的经济损失,己成为危害养禽业的重要细菌病之一,因此,如何防控该病成为养禽业面临的一项艰巨的任务。此外,APEC与引起人类尿道感染的尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli,UPEC)具有很大的相似性,因而APEC目前也被认为是一种食源性的病原菌,具有重要的公共卫生意义。DNA芯片是一种稳定、实用、可行的全基因组分析方法,能够探索病原体的分子致病机制,还可以分析细菌病原体在与宿主相互作用时的全局基因表达模式,有助于识别毒力因子及其对应的调控机制。本研究选取APEC 02血清型代表性菌株E058为模式菌株,利用DNA 芯片研究其在感染鸡体内的转录组学,通过数据分析筛选差异表达基因,并对潜在的毒力基因进行研究,拟通过本研究弄清APEC在感染宿主体内的基因转录表达谱,并进一步挖掘潜在的毒力基因,为揭示APEC的致病机理提供理论依据。1.基于DNA芯片分析APEC E058株在感染鸡体内的转录表达谱本研究选择代表性的APEC分离株E058,感染1日龄无特定病原体(specificpathogen free,SPF)鸡,从感染鸡血液中收集菌体,并以E058株在体外LB培养条件下的菌体作对照,以包含UPEC代表性菌株CFT073以及非致病性菌株K12全基因组序列的商品化 DNA 芯片(Affymetrix GeneChip(?)E.coli Genome 2.0 Array),在全基因组范围内,测定APEC E058株在感染鸡体内、外基因的表达水平,从而揭示APEC在感染宿主体内的基因表达规律。结果显示,APEC E058株在感染鸡体内表达显著上调的基因共有245个,显著下调基因共有369个,差异表达基因主要涉及细菌生理代谢、铁摄取转运、毒力、压力应激和生物学调控等方面。根据基因芯片分析结果选取了 12个差异表达基因(8个上调和4个下调基因)经荧光定量PCR分析来验证芯片分析获得的数据,结果表明荧光定量PCR确定所选基因的表达水平与基因芯片的结果一致,由此可以确定基因芯片结果的可靠性。同时,依据芯片结果,筛选APEC E058株在体内表达显著上调的基因yjiY,sodA,phoB和spy,运用基因敲除技术进行缺失突变,通过比较亲本株和突变株对1日龄雏鸡的致病力,初步了解和推测所选基因对致病性方面的影响。结果显示,APEC E058的毒力并未因yjiY,phoB和spy基因的缺失而下降,但是sodA缺失后,APECE058对雏鸡的致病力显著下降,表明sodA可能作为潜在的毒力基因参与APEC的致病进程,接下来进一步对sodA基因的功能和致病力进行评价。该研究对于明确目标基因在体内的表达水平与其致病作用间的关系,即在体内表达水平明显上调的基因是否为真正毒力基因提供依据。2.禽致病性大肠杆菌sodA突变株的构建及其致病性研究超氧化物歧化酶SodA作为一种抗氧化应激因子,在细菌抗吞噬细胞的氧化效应中发挥着重要作用。它对于APEC毒力的直接影响至今还未见报道。本研究旨在研究抗氧化相关基因sodA与APEC致病性之间的关系,为揭示APEC的致病机理及进一步构建APEC弱毒疫苗株奠定基础。本文运用λ Red重组系统构建E058ΔsodA基因缺失突变株,之后将带有相应启动子的sodA基因完整阅读框插入到低拷贝质粒pACYC184中,通过电转化突变株来筛选获得回复株。生长曲线的测定结果显示,在LB培养基中,突变株生长速度与野生株E058相似,并未表现出明显差异,但在含H2O2的LB培养基中,E058ΔsodA突变株的生长速度显著低于野生株;体外竞争试验结果显示,在LB培养基中,突变株表现为轻度致弱;血清杀菌试验表明突变株和野生株对SPF鸡血清杀菌作用不敏感;菌株生物被膜检测结果显示突变株的被膜形成能力与野生株相当;体外模拟体内环境应激条件下的细菌存活实验结果显示,突变株对H2O2比较敏感,而对强酸、强碱、高渗透压、尿素等环境均不敏感;鸡巨噬细胞HD-11细胞吞噬与胞内细菌增殖试验结果显示,与野生株相比,突变株E058ΔsodA对HD-11细胞抗吞入和定植能力均下降;半数致死量实验结果显示,与野生株相比,突变株的致病力下降约100倍;35日龄的SPF鸡体内定居与持续试验结果表明,E058ΔsodA突变株在各脏器的定居与持续能力均低于野生株E058。上述结果表明,SodA是APEC的一种重要的毒力因子,对其致病性起着关键的作用。