除了探索生命奥秘的科学价值外，干细胞的研究将在人工器官、组织工程、创伤修复和人体功能重建的临床医学中有着极为广阔的应用前景。作为人体干细胞研究的外延，各种动物、特别是医学相关动物干细胞的研究也已悄然兴起。 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)不仅具有自我更新和多向分化潜能，而且是造血系统的主要支持细胞，被认为是临床干细胞治疗的理想细胞来源和基因治疗的理想细胞载体。免疫排斥和器官的获得是当今移植的两大障碍，干细胞移植的核心问题仍是免疫学问题。 降低移植物免疫原性和抑制受体免疫系统功能是当前同种异体临床和实验模型中常用的的避免和延迟排斥的方法。MSCs在同种异体临床和实验模型中移植后，能被宿主“接受”，并且在宿主体内长期存活(Horwitz et al．，2002)。不仅如此，将MSCs与同种异体皮肤共同移植后，皮肤存活时间明显延长(Bartholomew et al．，2002)；与造血干细胞共同移植后，HSC“存活”率提高(Koc et al．，2000)，以上资料提示，MSCs可能具有低免疫原和免疫调节特性。最近，对MSCs抑制同种异体T淋巴细胞增殖活性的免疫调节研究也取得较大进展，在干细胞研究领域掀起了新四川大学博士学位论文一轮热潮(Tse et al.，2003;Di Nieola et al.，2002;Krampera et al.，2002)。 供器官来源严重不足的问题已严重阻碍了器官移植术的推广和应用，无论怎样开发，人体器官总是有限的。面对这样严峻的考验，异种移植己被考虑为同种异体移植可能的有效替代途径之一。免疫排斥仍然是异种移植的第一障碍，Saito等(1999)的研究极大突破了以往人们对异种移植免疫排斥的认识，为异种成体干细胞移植提供了新的契机，但迄今为止，关于MSCs在异种移植中的免疫调节现象及其分子机制的研究少之又少，不利于异种MSCs的开发和应用。 版纳微型猪近交系(banna mini一pig inbred一line，BMI)己近交繁育到第20世代，为世界唯一育成的近交系大动物，是异种移植中很有希望的供器官源。此近交系猪来源的MSCs在干细胞治疗的基础和临床研究中尤有价值。然而，MSCs的衰老和有限的增殖能力限制了它在体外的大量增殖及对其生物学特征的深入理解，从而阻碍了其在临床和实验体系中的应用，建立成体MSCs永生细胞系迫在眉睫。有文献报道，表达猴病毒40(simian virus 40，SV4o)大T抗原足以使某些体细胞和干细胞逃避衰老而永生化，因此该研究旨在(1)通过转基因技术将SV40抗衰老基因导入BMI一MSCs，构建永生细胞系，并鉴定永生化MSCs干细胞形态和生长特性，特异抗原表达，多向分化潜能和致瘤性，探讨其在移植和材料生物相容性评价中的应用前景。(2)应用单向淋巴细胞混合培养模型，系统研究永生化BMI一MSCS对异种T淋巴细胞增殖的免疫原及免疫调节特性，初步探讨了其免疫抑制的分子机制，展望其在免疫调节和创伤修复中的应用前景。材料与方法 永生化BMI一MSCs的构建:密度梯度离心和贴壁法从第18世代BMI的骨髓中分离原代MSCs。将含有SV40大T抗原和新霉素抗性基因的质粒pSV3neo导入第3代BMI一MSCs。细胞增殖，干细胞标一记物表达，四川大学博卜学位论文分化潜能，衰老和致瘤性等用常规方法检测。 1.2x1O4hPBLS分别与等比例丝裂霉素C处理的永生化BMI一MSCs，BMI一PBLs，人脐静脉内皮细胞株ECV-304或10林g/m 1 Co叭于96孔板共培养6天，以确定永生化BMI一MSCS的免疫原性。调整BMI一MSCS的剂量，加入时间和混合培养时间，评价BMI一MSCS对hLPBL作用的剂量和时间依赖关系。用培养池隔离BMI一MSCs和hPBLS，混培后评价细胞·细胞接触对抑制效应的影响。TGF一pl、FasL和IL一10抗体加入混培体系，观察它们是否能阻碍BMI一MSCs的抑制作用。用MTS法测定细胞增殖。结果以刺激指数51(Stimulation Index)和抑制率表示。结果 (l)原代BMI一MsCs持续增殖20代后，生长停滞，SA一p一Gal阳性率高达85%，流式分析显示，第15代BMI一MSCs在DNA含量小于2n的区域出现明显的“凋亡峰”，提示此细胞群体在传代过程中，细胞逐渐衰老。 (2) sv40转基因BMI一MSCs连续传180代后仍保持旺盛的增殖能力，而仅少量细胞SA一p一Gal表达阳性，细胞凋亡率极低，导入SV40的BMI一MSCS‘。寿命，，明显延长，获得‘泳生”。 (3)sv40转基因BMI一MSCs保持了正常BMI一MSCs的细胞形态，克隆生长特性、以及干细胞特异抗原的表达。明确了单克隆抗体SH一2、SH一3、SH一4、SB一10、SB一20、SB一21对应抗原在BMI一MSCs的表达分布规律。 (4)永生化BMI一MSCs保持了正常BMI一MSCs的成骨分化功能，能够促进多孔陶瓷材料的体内成骨。 (5)永生化BM卜MSCs与正常BMI一MSCs一样，生长有锚着依赖性，在裸鼠体内未表现致瘤性。 (6)永生化BMI一MSCs不引起hpBLs的增殖反应，而同为BMI来源四川大学博上学位论文的PBLs，ECV一304和ConA却能刺激hPBL增殖。结果提示BMI一MSCs可逃避异种T细胞的识别，具有低免疫原性。 (7)永生化BMI一MSCs对抗原或非抗原刺激引起的异种T细胞增殖均有抑制效应，且呈时间和剂量依赖关系。此结果提