雄激素分泌组织构建中的种子细胞优化和移植后促性腺激素的调节研究背景由于先天性疾病、环境污染、工作压力日益加剧和人口老龄化等原因，雄激素缺乏性疾病的发病率具有逐年上升的趋势。因创伤、肿瘤等造成的睾丸缺失也常见于临床，针对这类疾病，目前尚无满意的治疗措施。组织工程技术的不断进步实现了构建雄激素分泌组织的可能，有希望为治疗上述疾病提供理想的治疗手段。组织工程技术构建雄激素分泌组织弥补了传统睾丸假体无法同时补充激素的缺憾，还可避免单纯细胞移植吸收过快、激素分泌功能难于持久的缺点，但也面临着众多技术问题的制约。其中种子细胞来源问题一直是组织工程化雄激素分泌组织研究的瓶颈。本课题组在前期研究中已经证实，采用差速贴壁法能够从不同种属的雄性睾丸内获得高纯度的Leydig细胞，初步地解决了工程化雄激素分泌组织研究种子细胞来源缺乏的问题。但新方法尚缺少与传统方法在得率、纯度和睾酮分泌能力上的定量比较，而最佳的贴壁培养时间也缺少得率和纯度上的验证。其次Leydig细胞的功能调控尚需要睾丸支持细胞，在构建中使用睾丸整体消化所得细胞作为种子细胞也被证实可获得比单纯使用间质细胞更好的结果。目前两者的比例对于细胞移植治疗和雄激素分泌组织的构建效果具有何种影响尚不得而知。此外，差速贴壁法中间质细胞的分离后所残留的结构完整的曲细精管，为进一步分离纯化Sertoli细胞提供了可能。除种子细胞问题外，前期研究中采用组织工程方法构建出的雄激素分泌组织移植后虽能在18周内维持较高水平的睾酮分泌能力,并在组织学上观察到在移植物中的血管化,但未能证实其分泌能够接受机体下丘脑-垂体的调控，从而真正按照生理节律分泌睾酮，因此仍需要进一步进行实验验证。研究目的本研究拟通过比较差速贴壁法和传统Percoll梯度密度离心法所获得的两组大鼠Leydig细胞在得率和纯度上的差别，验证新方法的可行性，并明确差速贴壁法中不同贴壁时间对细胞得率和纯度的影响；进一步从差速贴壁法消化残留的曲细精管中分离纯化出Sertoli细胞，并验证其得率和纯度，与LC按照不同比例共同培养后检测在睾酮分泌能力上的差异；通过体外构建及去势动物回植实验，检验分次消化的Leydig细胞和Sertoli细胞共同作为雄激素分泌组织种子细胞的可行性，以及下丘脑-垂体-性腺轴对其分泌能力有无调节作用，为雄激素分泌组织构建研究提供种子细胞的优化方案和移植后的功能评估。研究方法一.差速贴壁法和梯度密度离心法分离纯化大鼠LC：消化所得细胞悬液分为5组，分别接受1、2、3、12小时的贴壁培养和进行梯度密度离心，所的细胞在分离即刻和培养72后分别进行3β-HSD流式细胞学检测，同时行细胞组织形态学鉴定和分泌功能的检测。二.分离纯化大鼠SC：在差速贴壁法分离出LC之后，对残留的曲细精管使用分次消化法进一步分离纯化出SC，检测得率和纯度，并行细胞组织形态学鉴定其特性，培养72小时后，与LC按照1:1、1:4、1:9、0:1四种浓度混合培养，检测睾酮分泌情况。三.分步消化的LC和SC作为种子细胞构建雄激素分泌组织：按上述方法分离纯化的LC和SC按照原始比例混合后接种于生物材料支架上，体外培养24小时候回植于大鼠腹腔，定期检测血清睾酮和LH，与去势鼠进行对比。四.对受移植大鼠进行LHRH激动剂的干预：LHRH激动剂注射受移植大鼠、正常大鼠、去势大鼠皮下，并以生理盐水注射另一组受移植大鼠，分别检测在短期和长期两种干预方式下，各组大鼠在血清睾酮和LH水平上的差异，并昼夜节律对受移植大鼠进行饲养和采血，分析血清睾酮和LH的昼夜差异。研究结果第一部分差速贴壁法和梯度密度离心法的比较2小时是差速贴壁法分离Leydig系细胞的最佳时机，在细胞得率[(2.04±0.26)×106个/每克睾丸]、纯度[(75.2±3.1)%]和睾酮分泌能力上均优于密度梯度离心法(P＜0.05)，该方法对Leydig干细胞有较好的保留，并且操作简便高效，具有可重复性，适用于Leydig细胞移植治疗和组织工程化雄激素分泌组织的构建。第二部分Leydig细胞和Sertoli细胞的分步消化和体外培养比例睾丸组织经差速贴壁法消化后残留的曲细精管再经胰酶和胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶混合溶液连续消化后，SC得率(3.5±0.62)×106/每克睾丸，细胞存活率达95%以上。两种细胞混合培养时的，LC和SC按照9：1比例混合培养组的睾酮的下降速度要慢于单纯的间质细胞。第三部分促性腺激素对混合细胞构建的雄激素分泌组织的调节分步消化得到的LC和SC与支架材料都能良好地复合，所构建的组织工程化雄激素分泌组织在3个月的观察期内能够保持一定的体积和较稳定的分泌功能，LHRH激动剂证实了组织工程技术构建的雄激素分泌组织在体内可接受下丘脑-垂体的上调增加分泌，所分泌的睾酮也可以对其产生负反馈。研究结论本研究证实差速贴壁法能够有效获得大鼠睾丸Leydig系细胞的各级细胞成分，比percoll梯度密度离心法更便捷高效，LC的得率、纯度和分泌功能均优于后者；通过分步消化，能够在获得大量纯化LC的同时，分离纯化出SC。以混合的纯化LC和SC共同作为种子细胞构建出的雄激素分泌组织在移植后具有良好的功能，其睾酮分泌能够接受下丘脑-垂体的上调，对于雄激素分泌组织构建研究中的种子细胞比例和体内环境下的分泌功能调节有着重要意义。