论文部分内容阅读
目的：Toll样受体(TLR)是参与非特异性免疫的一类重要分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。新近研究发现，许多微生物组分的抗癌免疫疗效是通过TLR信号通路介导的。本实验通过活化TLR4诱导单核细胞性白血病THP-1细胞发生凋亡，并以此为切入点研究活化TLR4诱导细胞凋亡的分子机制，为选择TLR作为靶点治疗单核细胞性白血病提供理论依据。方法：(1)RT-PCR检测基因的表达。(2)流式细胞术检测蛋白质的表达。(3)ELISA检测分泌蛋白的表达。(4)PI-Annexin V染色检测凋亡水平。(5)抗体中和实验验证细胞因子与THP-1细胞凋亡的相关性。(6)Western Blot检测细胞内信号传导分子的活化。结果：RT-PCR结果显示THP-1细胞表达除TLR3以外所有的TLRs，进一步流式细胞术分析证实THP-1细胞表面表达CD14、TLR2、TLR4蛋白，TLR4的配体LPS刺激后，CD14、TLR2、TLR4的表达上调，同时LPS也能活化TLR4信号传导通路包括ERK、JNK、P38和NF-kB，说明THP-1细胞表达功能性TLR4。PI-Annexin V染色分析发现LPS活化TLR4诱导THP-1细胞的凋亡，并呈剂量依耐性和时间依耐性。LPS所诱导的细胞凋亡与上调凋亡相关细胞因子TNFα和TRAIL有关，TNFα、TRAIL中和抗体阻断因子的作用后，凋亡水平有一定的下降。另外，LPS还下调了Bcl-2的表达，同时上调BAK的表达。Western Blot分析也发现LPS不仅诱导了Caspase 8的活化，同时也诱导了Caspase 9的活化。因此，TLR4不仅通过受体凋亡途径同时通过线粒体凋亡途径诱导细胞的凋亡。此外，LPS活化TLR4还下调了Caspase 8抑制蛋白FLIP_L的表达，从而更有利于凋亡的发生。结论：LPS通过活化TLR4诱导THP-1细胞发生凋亡，此凋亡过程既有死亡受体介导的细胞凋亡信号通路参与又有线粒体介导的细胞凋亡信号通路参与。LPS活化TLR4还下调了凋亡抑制蛋白FLIP_L的表达从而促进THP-1细胞凋亡。