目的:Ephs作为受体酪氨酸激酶的最大亚型,在细胞增殖、黏附、生存等方面起到重要作用。课题组前期发现Eph/ephrin家族的成员Efnb3,在佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）诱导的急性皮肤炎症模型中,Efnb3-/-小鼠能够减轻表皮增厚和相关炎症介质的表达;并且在甲醛诱导的小鼠足底炎症模型中,Efnb3-/-小鼠足底皮肤中IL-6、TNF-α的含量明显降低。经文献调研我们发现,Ephs受体与ephrins配体结合,可指示肠道细胞的正确定位,在维持正常肠道稳态环境中起到重要作用,因此,我们利用结肠炎模型探究Efnb3与炎症的发生是否相关。炎症性肠病（IBD）是一种慢性炎症性疾病,临床表现为腹泻、腹痛、消化不良、体重减轻等,主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。据统计,在北美、欧洲的许多国家,IBD的患病率超过0.3%。近20年里,中国成为IBD发病率增长最快的亚洲国家,到2025年,患者可能达到150万。但是目前IBD的病因尚不明确,考虑可能跟遗传的易感性、免疫系统异常、环境因素有关。在各种因素作用下,肠道屏障被破坏,微生物进入肠腔,激活免疫细胞,释放炎性因子,导致炎症。本课题旨在:探究Ephrin-B3是否参与结肠炎及结肠癌的形成和发展,并对其机制进行系统的研究,为Ephrin-B3新的生物功能发现提供实验数据,也可为为结肠炎及结肠癌的生物靶向治疗提供新的策略。方法:第一部分:体内采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt,DSS）诱导ICR小鼠溃疡性结肠炎模型,每天记录体重,观察小鼠状态及便血、粪便形状等指标,计算疾病活动指数（DAI）。7天后处死小鼠,取小鼠结肠、脾脏,测量结肠长度、计算脾脏指数作为衡量结肠炎严重程度的指标。HE染色观察小鼠病理学改变,采用ELISA方法评价小鼠结肠组织中炎症因子的水平,利用TUNEL染色观察小鼠结肠细胞的凋亡情况,利用免疫荧光Ki67染色检测肠上皮细胞的增殖情况,并采用western blotting方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、p53、Cleaved-caspase 3的水平。Evans blue肠屏障实验用来观察小鼠肠道屏障通透性改变的情况,利用western blotting和免疫组化的方法检测紧密连接相关蛋白ZO-1、Occlundin及Claudin-1的水平。我们将从各方面探讨Efnb3对DSS模型诱导的小鼠结肠炎的影响。第二部分:采用无标记定量蛋白质组学技术分析Efnb3+/+和Efnb3-/-小鼠经过DSS造模后结肠样品的差异蛋白,寻找Efnb3在结肠炎模型中调控的蛋白,并对得到的蛋白进行Reactome数据分析;western blotting验证质谱结果及下游相关的信号通路和功能。选取ITGB4蛋白进行研究,并探索其调控的下游通路。根据蛋白质组学结果,选取另一变化倍数较大的Gremlin-1蛋白,利用western blotting方法进行验证;在HEK-293T细胞中分别高表达或者沉默Efnb3,观察该蛋白的变化,研究Efnb3对Gremlin-1的调控作用。利用western blotting和ELISA研究Efnb3、Gremlin-1及其下游NF-κB信号通路间的调控关系。第三部分:根据TCGA数据库下载数据,分析Efnb3表达量与结肠癌患者生存期、恶性程度之间的联系,利用western blotting检测Efnb3在人正常肠上皮细胞和几种人结肠癌细胞系中的表达量差异。体内利用氧化偶氮甲烷（azoxymethane,AOM）/DSS诱导ICR小鼠结肠癌模型,评价Efnb3对小鼠结肠癌的影响。结果:第一部分:DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中,相较于Efnb3+/+正常对照组小鼠,Efnb3+/+造模组小鼠体重明显下降,DAI评分升高,结肠长度明显变短,脾指数升高,结肠粘膜出现溃疡,炎症因子TNF-α、IL-6以及IL-1β分泌增加。与Efnb3+/+造模组小鼠相比,Efnb3--小鼠体重减轻较少,且DAI评分明显低于野生型小鼠,脾指数没有明显变化,肠绒毛排列有序,隐窝部位结构较完整,炎性细胞浸润较少,肠组织内炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放减少。TUNEL和Ki67结果显示Efnb3基因敲除后可以抑制结肠上皮细胞的凋亡,恢复上皮细胞的增殖能力,Efnb3敲除可抑制凋亡相关蛋白Bax、p53与Cleaved-caspase 3的水平。炎症因子释放会破坏肠屏障,而Efnb3敲除可以改善肠道通透性,且紧密连接蛋白ZO-1、Occlundin及Claudin-1的水平明显升高。第二部分:利用无标记定量蛋白质组学结果分析,共定量1317个蛋白,发现有显著差异的蛋白95个,其中63个蛋白表达上调及32个蛋白表达下调。通过Reactome信号分析,发现与血小板脱颗粒、激活、信号传递,整合素的MAPK信号传导等信号通路有关,其中四条通路与整合素（Integrin）有关,整合素在组织修复、炎症、感染和血管生成中起重要作用[1]。因此我们首先选取ITGB4蛋白进行研究,采用western blotting首先在细胞上高表达Efnb3后,ITGB4蛋白水平下降,p-AKT的激活受到抑制;然后在Efnb3-/-小鼠的肠组织验证:Efnb3被敲除后,ITGB4水平上升且同时p-AKT被激活。采用LPS刺激Caco-2细胞模拟炎症环境,发现敲除Efnb3后,紧密连接蛋白ZO-1、Occlundin及Claudin-1的水平明显升高,Efnb3高表达时紧密连接蛋白ZO-1、Occlundin及Claudin-1的水平下降;高表达ITGB4后,紧密连接蛋白ZO-1、Occlundin及Claudin-1的水平上升,沉默Efnb3后则ITGB4的水平下降。根据蛋白质组学结果,选取另一变化较大蛋白Gremlin-1,它是一种骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂,常以分泌蛋白和膜蛋白形式存在。在组织上进行验证,在293T细胞上通过高表达或者敲低Efnb3发现Gremlin-1也随之增多或降低,在RAW264.7细胞上高表达或敲低Efnb3,考察对NF-1κB通路的影响。敲低Efnb3后,抑制NF-κB通路,p-IKKα/β、p-P65、p-IκBα蛋白的水平降低;高表达Efnb3后,则激活NF-κB通路,p-IKKα/β、p-P65、p-IκBα蛋白的水平升高。在RAW264.7细胞上高表达或敲低Gremlin-1,发现敲低Gremlin-1后,p-P65、iNOS、COX2等炎症介质下降。在RAW264.7细胞上高表达Efnb3的前提下敲低Gremlin-1,不能激活NF-κB通路,炎症因子释放的改变没有显著性差异,表明Efnb3通过Gremnlin-1调控NF-κB通路从而影响炎症因子的释放。第三部分:通过数据库查询,发现Efnb3的表达量与结肠癌患者的生存期呈负相关。且随着肿瘤恶性程度升高,Efnb3的表达也随之升高。我们分别在人正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞系中观察Efnb3的表达,发现其在结肠癌细胞中表达多于正常细胞系。利用AOM/DSS模拟原位结肠癌的模型,可以观察到与Efnb3+/+小鼠造模相比Efnb3-/-小鼠肿瘤数较少,结肠绒毛较完整,少见癌组织形态。结论:Efnb3敲除一方面通过调控增加ITGB4,激活下游AKT通路,改善肠屏障从而保护结肠炎;另一方面通过抑制Gremlin-1蛋白,抑制NF-κB通路从而抑制炎症因子释放,从而改善结肠炎。Efnb3敲除减少结肠癌的发生发展。