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骨保护素（osteoprotegerin,OPG）是近年来新发现的在破骨细胞的分化和发育过程中具有重要负性调节作用的细胞因子。而且在许多与骨代谢有关的疾病发病中都发挥着重要作用,但是在更多生理、病理条件下的作用机制,尚需深入研究。因此应用基因工程制备大量的OPG可为进一步基础和临床应用性研究提供坚实的物质基础。 本研究用RT-PCR方法将人OPG cDNA的全长编码基因扩增后,利用酶切和连接技术,将其克隆于哺乳动物表达载体pcDNA3.1/CT-GFP上,构建了OPG的重组表达载体pcDNA3.1/OPG-GFP。将其转染COS7细胞进行瞬时表达,经ELISA和Western blot证实此重组载体的功能。另外,将载体pcDNA3.1/CT-GFP进行了修改,将驱动外源基因表达的CMV早期启动子中增强序列去除,再将OPG cDNA克隆于此新载体上,构建了表达载体pcDNA-CMVT/OPG-GFP-,并对比OPG在这两个载体内的表达水平。 为了能够在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（CHO-dhfr-）内高效稳定表达OPG,并迅速筛选出高表达细胞株,将重组载体pcDNA3.1/OPG-GFP-插入一个带弱化启动子的DHFR表达单位。DHFR表达单位的构建方法是,应用PCR突变技术在引物的5’端添加了互补序列,分别扩增了弱化的SV40启动子、小鼠DHFR的cDNA编码序列和SV40 Poly（A）信号序列后,将三者重叠延伸成带弱化启动子的DHFR表达单位,并将其克隆于载体pcDNA3.1/OPG-GFP-后,使原载体获得一个新的选择性标记基因。将其线性化后转染CHO-dhfr-细胞,首先在无氨甲喋呤（methotrexate,MTX）的培养基中,筛选出有目的基因表达的细胞株,然后通过MTX梯度浓度的加压,筛选高效、稳定表达OPG的细胞株。 经ELISA和Western blot证实载体pcDNA3.1/OPG-GFP有表达OPG的活性。而且去除CMV启动子中增强序列的OPG表达载体与正常CMV启动子的载体相比在COS7细胞内表达OPG的水平相近,达200～500ng/ml。将携带DHFR表达