【目的】　　1.在纯钛表面制备含有不同管径TiO2纳米管的微纳米混合形貌，并对光滑、微米、微纳米表面形貌的材料学性能进行比较。　　2.评价纯钛表面经 TiO2纳米管修饰的微纳米混合形貌对 MG63成骨细胞生物活性的影响。　　3.检测Hedgehog-Gli1信号通路是否参与种植材料表面不同改性对细胞功能的影响，探讨纯钛表面微纳米混合形貌Hedgehog-Gli1信号通路对MG63成骨细胞生物活性的调控机制。　　【方法】　　1.采用酸蚀法在钛片表面蚀刻微米级粗糙结构，并采用阳极氧化方法在其表面附加不同管径的 TiO2纳米管，制备具有微米、纳米混合结构的表面形貌。采用扫描电镜、表面3D轮廓测量仪和蛋白吸附试验方法对不同处理组钛片表面形貌、表面粗糙度以及蛋白吸附能力进行检测。　　2.以MG63细胞为成骨细胞实验模型接种于不同表面形貌的钛片上，采用荧光染色法在荧光显微镜下观察不同处理组钛片表面MG63细胞的早期粘附以及铺展情况，MTT法检测钛片表面细胞第1 d、3 d、5 d的增殖活力，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色法及ALP定量试剂盒法检测钛片表面细胞中ALP表达活性，实时定量qRT-PCR法检测钛片表面细胞中成骨相关基因BMP-2、ALP、Runx2、OCN的表达水平，评价不同钛片表面形貌对MG63成骨细胞生物活性的影响。　　3.将MG63细胞以1.3×104个/cm2的密度接种于不同表面形貌的钛片上，采用qRT-PCR法检测钛片表面细胞中Hedgehog-Gli1信号通路中Sonic hedgehog（Shh）、Smoothened（Smo）以及Gli1的mRNA表达水平，Western Blot法检测其蛋白表达量，评价 Hedgehog-Gli1信号通路在不同钛片表面形貌上的活性变化；　　4.将Hedgehog-Gli1信号通路特异抑制剂环杷明（Cyclopamine）加入到细胞培养液中，采用qRT-PCR法检测不同处理组钛片表面细胞中 Hedgehog-Gli1信号通路相关基因Shh、Smo、Gli1以及成骨相关基因BMP-2、ALP、Runx2、OCN表达水平的变化，Western Blot法检测Hedgehog-Gli1信号通路相关蛋白的表达量情况，MTT法检测钛片表面细胞的增殖活力，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶（ALP）显色法及ALP试剂盒法检测钛片表面细胞中ALP表达活性的变化。　　【结果】　　1.微纳米混合结构材料学性能的检测　　1.1纯钛表面氟酸酸腐蚀处理后形成具有微米级粗糙表面形貌（R组），在此基础通过阳极氧化法，分别在电压10V（R10组）和20V（R20组）下附加了25 nm、70 nm不同管径的纳米管阵列，制备出含有TiO2纳米管的微纳米混合形貌。　　1.2表面3D轮廓仪显示微米级形貌R组和微纳米形貌R10、R20组的表面粗糙度显著大于光滑形貌S组（均P<0.05），而在R、R10和R20三组钛片表面形貌中的表面粗糙度未见明显差异。　　1.3蛋白吸附试验结果显示在各个时间点上微米 R组、微纳米 R10、R20组钛片表面蛋白吸附能力显著高于光滑S组，并以微纳米组的蛋白吸附能力最强（均P<0.05）。　　2.钛片微纳米混合形貌表面对MG63成骨细胞生物活性的影响　　2.1细胞早期粘附能力检测在30 min、60 min时间点中，四组钛片表面的细胞粘附数目均随着接种时间的延长而增加，微米R组、微纳米R10、R20组钛片表面细胞粘附水平均明显高于光滑S组（P<0.05），而在R、R10和R20组中没有显著的差异。　　2.2荧光显微镜观测显示光滑 S组钛片表面的细胞呈细长梭形，周围未见明显的伪足及微绒毛，而微纳米组成骨细胞铺展面积增大，细胞呈多边形并交错相连，表面有大量的板状、丝状伪足伸出，可见密集的微绒毛。而微米表面细胞形态介于以上两组之间，仅有少量伪足和微绒毛。　　2.3细胞在不同处理组钛片表面的增殖能力通过MTT试剂盒来检测，结果显示细胞在微纳米组钛片上具有更好的增殖能力，并以微纳米R20组的细胞增殖能力最强。　　2.4 ALP显色检测结果显示，微纳米混合形貌R10和R20组呈现出明显的深蓝紫色，微米组及光滑组都较浅，颜色越深代表ALP活性越强。ALP定量检测结果显示微米S组的ALP活性最低，微纳米混合形貌R10和R20组的ALP活性显著增高，并以R20组增强最为显著。　　2.5各组细胞成骨相关基因 BMP-2、ALP、Runx2、OCN的表达随时间延长均有增高，微纳米R20组显著上调细胞BMP-2和ALP mRNA的表达，R10组次之。在细胞培养第7 d的时候，Runx2在微纳米R20组钛片表面细胞中的mRNA表达水平比微米组显著增强；　　3.钛片微纳米混合形貌表面Hedgehog-Gli1信号通路对MG63成骨细胞生物活性的调控作用　　3.1各组细胞Hedgehog-Gli1信号通路相关基因Shh、Smo以及Gli1的表达随时间延长均有增高，微纳米混合形貌改性显著上调Shh、Smo以及Gli1的基因和蛋白表达水平，并以微纳米R20组的上调作用最为显著。而在光滑S组和微米R组中Shh、Smo以及Gli1的表达水平没有明显差异。　　3.2在各组钛片表面细胞中，环杷明显著抑制了Hedgehog-Gli1信号通路相关Shh、Smo、Gli1的基因及蛋白表达，加入环杷明（Cyclopamine）的微纳米组表面 Hedgehog-Gli1信号通路活性水平与没有加入环杷明的光滑组、微米组的大致相同。　　3.3 MTT法检测环杷明对细胞增殖活力的影响结果显示，环杷明显著抑制了微纳米 R10、R20组钛片表面细胞的增殖活力，加入环杷明的微纳米组表面细胞增殖活性水平与没有加入环杷明的光滑组、微米组大致相同。　　3.4 ALP显色及定量法检测环杷明对细胞ALP活性的影响结果显示，环杷明显著抑制微纳米R10和R20组钛片表面细胞ALP表达活性（均P<0.05），加入环杷明的微纳米组表面ALP活性水平与没有加入环杷明的光滑组、微米组的大致相同。　　3.5荧光定量 PCR法检测环杷明对细胞中成骨相关基因 BMP-2、ALP、Runx2、OCN表达的影响结果显示，环杷明显著抑制微纳米R10和R20组钛片表面细胞中BMP-2、ALP的基因表达（P<0.05），而Runx2只在微纳米R20组表面表达显著下降（P<0.05），加入环杷明的微纳米组表面成骨相关基因表达水平与没有加入环杷明的光滑组、微米组的大致相同。　　【结论】　　1.通过氢氟酸酸蚀法结合阳极氧化法可制备出具有 TiO2纳米管的微纳米混合形貌结构。　　2.钛片表面微纳米混合形貌改性能够更加有效地增强成骨细胞的早期粘附、增殖、分化能力，为成骨细胞提供一个更具生物兼容性和平衡性的仿生态环境，提高了钛种植体材料的生物活性。　　3.微纳米混合形貌上调Hedgehog-Gli1信号通路相关基因和蛋白表达，被激活的 Hedgehog-Gli1信号促进了成骨细胞在钛片微纳米混合形貌表面的成骨增殖和分化能力。