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第一部分：LAP+CD4+T细胞在结直肠癌肿瘤微环境中的分布情况及临床意义目的：检测LAP+CD4+T细胞在结直肠癌患者肿瘤微环境中的分布情况,分析其与CD4+CD25+Treg及临床病理因素的相关性,初步探讨LAP+CD4+T细胞在结直肠癌发生、发展中的作用。方法：收集2014年1月-2014年3月期间广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科收治并行手术治疗的50例结直肠癌患者临床病理资料,采集所有患者术前外周血,术后肿瘤组织和相应正常粘膜组织标本,同时采集25例健康志愿者外周血作为对照组。酶消化法消化肿瘤组织及相应正常粘膜组织,用梯度密度离心法(外周血)和非连续梯度密度离心法(组织标本)分离出淋巴细胞,流式细胞技术检测LAP+CD4+T细胞和CD4+CD25+Treg的分布比例,比较结直肠癌患者与健康志愿者外周血中LAP+CD4+T细胞分布比例差异,结直肠癌肿瘤组织与相应正常粘膜组织中LAP+CD4+T细胞分布比例差异；分析LAP+CD4+ T细胞和CD4+CD25+Treg及临床病理特征的相关性。结果：运用流式细胞技术检测50例结直肠癌患者和25位健康志愿者外周血及组织标本LAP+CD4+T细胞占CD4+T细胞比例,结直肠癌患外周血(9.440%±3.18%)高于正常人外周血(1.49%±1.00%),P=0.000；结直肠癌患者肿瘤组织(11.76%±3.74%)高于相应正常组织(3.87%±1.64%),P=0.000；其中肿瘤组织中LAP+CD4+T细胞的分布比例最高；Pearson相关性分析结果表明,肿瘤组织中LAP+CD4+T细胞与CD4+CD25+Treg细胞成正相关,r=0.327, P=0.02; LAP+CD4+T细胞的分布比例与肿瘤的TNM分期,远处转移,CEA水平相关,P<0.05。结论：LAP+CD4+T细胞在结直肠癌患者外周血和肿瘤组织中分布比例升高,其中在肿瘤组织中的比例最高。肿瘤组织中LAP+CD4+ T细胞与CD4+CD25+Treg细胞分布比例呈正相关,LAP+CD4+T细胞的分布比例与肿瘤的TNM分期,远处转移,CEA水平相关,以上结果表明LAP+CD4+T细胞易聚集于结直肠癌肿瘤组织中,可能参与了结直肠癌的发生、发展,起到促进肿瘤生长,转移的作用。第二部分：结直肠癌肿瘤组织中LAP+CD4+T细胞的表型特征和细胞因子谱分目的：检测结直肠癌肿瘤组织中LAP+CD4+ T细胞的表型特征和细胞因子谱,探讨其在结直肠癌肿瘤微环境中促瘤作用的相关分子机制。方法：选取广西医科大学第一附属医院结直肠外科2014年4月至2014年6月初次手术治疗的33例经病理确诊的结直肠癌患者的外周血及肿瘤组织标本,酶消化法消化肿瘤组织,用非连续密度梯度离心法分离肿瘤组织中的淋巴细胞,流式细胞术分析LAP+CD4+T细胞和L AP-CD4+T细胞CCR7、 CD45RA、Foxp3、CTLA-4、CCR4、CCR5的表达,利用免疫磁珠分选法从肿瘤组织中分选出LAP+CD4+T细胞和LAP-CD4+T细胞,流式细胞术分析其纯度,台盼蓝法检钡(?)LAP+CD4+T细胞和LAP-CD4+T细胞的活性,RT-qPCR方法检测两种细胞细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-y、 TGF-βmRNA的表达,液相芯片技术检测两种细胞培养上清细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-y的浓度,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测TGF-β的表达水平。结果：流式细胞检测结果显示,结直肠癌患者(CRC)和健康志愿者(HD)外周血、相应正常组织中的LAP+CD4+T细胞主要表现中央记忆型(CM)而肿瘤组织中主要表现为效应记忆型(EM); LAP+CD4+T细胞与LAP-CD4+T细胞比较,低表达Foxp3,高表达CTLA-4、CCR4、CCR5 (P<0.05)；经免疫磁珠分选,CD4+T细胞纯度为93.48±2.20%,正选后LAP+CD4+T细胞的纯度为95.02±2.87%,负选后LAP-CD4+T细胞的纯度为94.75±2.76%,台盼蓝染色结果显示LAP+CD4+T细胞存活率为90.16±4.26%,LAP-CD4+T细胞存活率为92.99±2.98%；RT-qPCR结果显示LAP+CD4+T细胞高表达IL-10和TGF-p mRNA,与LAP-CD4+T细胞比较差异有统计学意义(P<0.05)；液相芯片技术和ELISA检测显示LAP+CD4+T细胞胞分泌高水平的IL-10和TGF-p,与LAP-CD4+T细胞比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：结直肠癌肿瘤组织LAP+CD4+T细胞主要表现为效应记忆型(EM)表明LAP+CD4+T细胞有更高的肿瘤富集趋势,更易聚积于肿瘤微环境中,肿瘤组织中LAP+CD4+T细胞低表达Foxp3；高表达CTLA-4、CCR4、 CCR5,表明其与传统的CD4+CD25+Treg不同,其调节特性不依赖于Foxp3的表达,具有独特的表型特征。LAP+CD4+T细胞分泌高水平的抑制性细胞因子IL-10和TGF-β可能参与了肿瘤的免疫逃逸机制。第三部分：LAP+CD4+T疫调节功能的体外研究目的：体外研究LAP+CD4+T细胞的免疫调节功能,探讨其对效应T细胞的免疫抑制途径及作用机制。方法：收集2014年7月-2014年8月广西医科大学结直肠肛门外科结直肠癌患者术后肿瘤组织标本12例,酶消化法消化肿瘤组织,非连续密度梯度离心法分离淋巴细胞,免疫磁珠法分选出LAP+CD4+T细胞和LAP-CD4+T细胞,用异体抗原anti-CD3mAb, anti-CD28 mAb, Human IL-2刺激,对两种细胞进行单独培养和共培养实验,CCK-8法检测细胞的增殖能力,transwell、室实验检钡ILAP+CD4+T细胞是否可通过非接触抑制LAP-CD4+T细胞的增殖。细胞因子拮抗实验验证anti-IL-10 mAbs和anti-TGF-p mAbs是否可逆转LAP+CD4+T细胞对LAP-CD4+T细胞的抑制作用。结果：两种细胞加异体抗原anti-CD3mAb, anti-CD28mAb, Human IL-2刺激,经过3天的体外培养后,LAP-CD4+T细胞组的OD值为0.85±0.16,LAP+CD4+T细胞组的OD值为0.32±0.11,差异有统计学意义(P<0.001),表明LAP+CD4+T细胞具有免疫无反应特性；将LAP+CD4+T细胞和LAP-CD4+T细胞按1：1培养,对照组贝LAP-CD4+T细胞单独培养,用异体抗原anti-CD3mAb, anti-CD28mAb, Human IL-2刺激,经过3天的体外培养后,结果显示LAP+CD4+T细胞与LAP-CD4+T细胞混合培养组OD值为0.48±0.18, LAP-CD4+T细胞单独培养组OD值为0.87±0.21,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05),表明LAP-CD4+T细胞具有免疫抑制性；transwell小室实验结果显示LAP+CD4+ T细胞可通过非接触抑制作用于LAP-CD4+T细胞,抑制其生长。细胞因子拮抗实验结果表明拮抗IL-10和TGF-p可部分逆转LAP+CD4+T细胞的抑制功能。结论：结直肠癌肿瘤组织中的LAP+CD4+T细胞具有免疫无反应性和免疫抑制性;LAP+CD4+ T细胞主要通过IL-10和TGF-β介导来发挥其抑制功能,拮抗两种细胞因子,可部分逆转其抑制效应；LAP+CD4+T细胞可能通过接触抑制和非接触抑制两种机制作用于效应T细胞。