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流感病毒的感染时刻威胁着人类的健康,但是宿主与病毒之间相互作用的机理仍不很清楚。宿主抗流感病毒的天然免疫应答起始于病原识别受体(PRRs,如:RIG-I,MAD5和TLR3)对病毒组分的识别,激活受体,再通过信号转导激活转录因子(包括:IRF3/7和NF-κB)等,然后迅速产生I和III型干扰素,后者诱导干扰素刺激基因表达,合成大量抗病毒蛋白。流感病毒需要依赖宿主细胞的相关因子、细胞机器完成其生命周期。近年来,越来越多的研究报道显示宿主因子在流感病毒感染与复制过程中发挥重要的作用。因此了解宿主因子在流感病毒感染与复制过程中所发挥的作用将有助于开发更为有效的抗流感药物。长链非编码 RNAs(Long non-coding RNAs,LncRNAs)是由 RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录形成的一类有潜在功能的RNAs,其长度超过200个核苷酸,没有功能性蛋白和多肽编码活性。LncRNAs能通过多种不同方式发挥功能,比如RNA-RNA,RNA-DNA以及RNA-蛋白相互作用等。LncRNAs参与染色质修饰、基因转录调控、RNA剪切加工及稳定性的调节等多种生命活动过程。本文开展如下研究,并获得相关结果:1、在流感病毒感染的细胞中,利用芯片分析长链非编码RNAs的表达水平,运用生物信息学(ORF Finder等软件)方法筛选,并通过RT-PCR验证具有显著差异表达的长链非编码RNAs,再利用空斑实验筛选到一条功能性长链非编码RNA,被命名为NRAV(Negative Regulator of Anti-Viral response,抗病毒应答的负调节因子)。2、RT-PCR检测发现许多细胞系中均有NRAV的表达,易感流感病毒的细胞系内的NRAV在感染WSN流感病毒后发生显著下调。RT-PCR验证,流感病毒、仙台病毒、呼肠孤病毒和单纯疱疹病毒感染均可以下调NRAV的表达。利用假病毒转导、LPS处理和血清饥饿处理细胞的研究结果发现NRAV表达水平的变化不是细胞的应激反应。综上推断,NRAV表达具有一定的广谱性,且其表达水平的下调与病毒的感染密切相关。3、在A549和293T细胞中稳定表达和沉默NRAV,RT-PCR验证过表达和干扰效果均显著,空斑实验结果分析表明过表达NRAV促进流感病毒的复制,干扰NRAV则抑制流感病毒复制。4、用三种软件RNAfold,Centroidfold和Genebee预测了 NRAV的二级结构,根据其二级结构设计了八个截短和缺失突变体,并构建了它们的稳定表达细胞系,空斑实验结果分析表明NRAV形成空间结构的RNA序列除了 nt 618-872外均对它的功能至关重要。5、我们应用多种方法(如:virion genomic RNA、Viral RNA、Cell RNA、Poly(I:C)、细胞因子、干扰RNA-模式识别受体和地西他滨(DAC))处理感染或不感染病毒的细胞,RT-PCR检测NRAV的表达水平,发现Viral RNA能使NRAV表达下调,流感病毒介导的NRAV的下调被DAC介导表达所抵消,其它处理均未使NRAV表达发生改变。实验结果表明NRAV的下调依赖于病毒的复制、蛋白合成和甲基化调控。6、功能实验表明NRAV促进流感病毒复制,已有很多研究表明干扰素刺激基因ISGs可以抑制流感病毒复制,因此,为了研究NRAV的作用机制,我们用qRT-PCR检测,发现在干扰NRAV的A549细胞系中IFIT2、IFIT3、IFITM3、OASL和MxA均表达升高,推测NRAV负调节大多数关键干扰素刺激基因(ISGs),包括IFIT2、IFIT3、IFITM3、OASL和MxA,但此推测仍需更多的实验加以验证。本文的研究对潜在的抗病毒天然免疫应答的复杂机制提出了一种新见解,宿主长链非编码RNAs在调控甲型流感病毒感染和复制中起重要作用。因此本文的研究具有重要科学意义。