第一部分尿毒症患者血管局部Klotho基因超甲基化与血管钙化的关系背景：最新研究证实人类血管平滑肌细胞是Klotho直接作用的靶点,血管局部Klotho表达下调参与血管钙化的发生发展,但血管局部Klotho低表达的原因尚不清楚。DNA甲基化是调节基因表达的一种表观遗传方式,启动子区CpG岛(即300～3000 bp富含CpG二核苷酸的区域的甲基化有沉默基因表达的作用。本研究旨在以ESRD患者为研究对象,探讨ESRD患者桡动脉局部Klotho基因超甲基化与血管钙化的关系。方法：2013.1～2013.12在复旦大学附属中山医院肾内科病房住院治疗并行动静脉内瘘手术的30例透析前ESRD患者为尿毒症组,同期于我院心外科病房行冠状动脉搭桥手术的10例年龄、性别匹配的患者作为对照组,均取得患者知情同意。术中分别取桡动脉和同级别的内乳动脉行H.E.染色观察血管内中膜厚度和血管管壁厚度/血管直径,茜素红钙盐沉积染色评估血管钙化,免疫组织化学染色评价a-SMA、OPN、Cbfα1、Klotho和DNMT1蛋白的表达水平。同时利用焦磷酸测序方法检测血管局部Klotho基因甲基化率和超高效液相色谱检测技术检测尿毒症组患者血清IS浓度。结果：尿毒症组患者内中膜厚度较对照组显著增厚(0.68±053mm vs.0.18±0.13mm,P<0.01),血管管壁厚度/血管直径亦显著高于对照组(0.34±0.19 vs.0.23±0.09,P<0.01)。尿毒症组中21例(70%)茜素红染色阳性,均分布在血管中膜,对照组无一例发生血管钙化(P<0.01)。血管局部a-SMA、OPN和Cbfα1染色均主要分布于血管中膜,尿毒症组αα-SMA染色阳性率显著低于对照组(30% vs.100%,P<0.01),OPN和Cbfα1染色阳性率显著高于对照组(87% vs.0%,P<0.01)(93% vs.0%,P<0.01)。尿毒症组患者血管局部Klotho基因甲基化率显著高于对照组(43.2±1.7%,8.7±0.8%,P<0.001)。血管局部Klotho、 DNMT1染色均主要分布于血管中膜,尿毒症组Klotho染色阳性率显著低于对照组(33.3% vs.100%,P<0.01),DNMT1染色阳性率显著高于对照组(70% vs.0%,P<0.01)。其中21例茜素红染色阳性的ESRD患者者血管局部Klotho甲基化率和血清IS浓度显著高于9例染色阴性者(41.8±3.7% vs.29.4±1.5%,P<0.001) (34.6±4.13 pg/m,29.8±4.23 pg/mlP<0.001)。进一步Pearson单因素相关分析显示尿毒症组患者血清IS浓度与血管局部Klotho甲基化率呈正相关(r=0.587,P<0.01)。结论：尿毒症患者普遍存在血管钙化和血管局部Klotho基因超甲基化,血管局部Klotho基因超甲基化与血管钙化密切相关。第二部分Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用机制背景：IS与ESRD患者心血管疾病死亡率和总死亡率相关,可通过诱导血管平滑肌细胞成骨细胞转分化而促进血管钙化,但是IS诱导血管钙化的具体机制目前尚不清楚。第一部分的研究证明尿毒症患者普遍存在血管钙化和血管局部Klotho基因超甲基化,血清IS浓度与血管局部Klotho基因甲基化率密切相关。本研究旨在以人主动脉血管平滑肌细胞为研究对象,从细胞层面探讨Klotho基因超甲基化在IS诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用和相关机制。方法：体外培养人主动脉血管平滑肌细胞,IS按0、200、500和1000μM的浓度梯度干预6天,采用茜素红染色观察钙盐沉积,Real-time PCR和Western blot检测a-SMA、OPN、Cbfα1ΟKlotho和不同DNMT的mRNA和蛋白表达水平,同时利用焦磷酸测序方法检测HASMC Klotho基因甲基化率。IS1000μM组培养基中加入不同浓度梯度的5-氮杂脱氧胞苷进行干预,观察茜素红染色、各基因表达水平和Klotho基因甲基化率的改变。结果：IS 1000μM组细胞外基质呈橙色,细胞结节处浓染,为钙盐沉积染色阳性。IS可以下调HASMC a-SMA mRNA和蛋白表达水平,上调OPN和Cbfa1的mRNA和蛋白表达水平,使HASMC逐渐丧失平滑肌细胞表型而发生成骨转化。IS 200、500和1000μM刺激6天可显著升高HASMC Klotho基因甲基化率(9±1%vs.4±0.7%, P<0.01)、(18±1.3 vs.4±0.7%, P<0.01)、(41±2%vs.4±0.7%, P<0.001)。IS 500和1000gM可显著下调HASMC Klotho mRNA和蛋白表达水平。同时IS可显著上调HASMC DNMT1 mRNA和蛋白表达水平。5-氮杂脱氧胞苷10μM干预可减轻IS诱导的细胞外钙盐沉积,上调a-SMA蛋白表达水平并下调Cbfa1蛋白表达水平,同时减低HASMC Klotho基因甲基化率(20+1%vs.41±2%,P<0.01)、上调HASMC Klotho蛋白表达水平,提示HASMC Klotho超甲基化可减轻硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化。结论：硫酸吲哚酚可诱导血管平滑肌细胞成骨转化,并可通过上调血管平滑肌细胞DNMT11的活性诱导Kloth o超甲基化,下调Klotho蛋白表达水平,阻断Klotho超甲基化可减轻硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化。第三部分Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚诱导的尿毒症大鼠血管钙化中的作用机制背景：尿毒症患者普遍存在血管钙化和血管局部Klotho基因超甲基化,血清IS浓度与血管局部Klotho基因甲基化率密切相关。硫酸吲哚酚可诱导血管平滑肌细胞成骨转化,并可通过上调血管平滑肌细胞DNMT1的活性诱导Klotho超甲基化,下调Klotho蛋白表达水平,阻断Klotho超甲基化可减轻硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化。本研究旨在以尿毒症大鼠为研究对象,从体内层面探讨Klotho基因超甲基化在IS诱导的尿毒症大鼠血管钙化中的作用和相关机制。方法：采用硫酸吲哚酚联合5/6肾切除的方法构建尿毒症大鼠血管钙化模型,24只SD大鼠采用两步法行5/6肾切除术,随机分为对照组、IS组和IS+5Aza-2dc组。24周后留取血液和尿液标本,大鼠处死后留取胸主动脉标本。行H.E.染色观察血管内中膜厚度和血管管壁厚度/血管直径,茜素红钙盐沉积染色评估血管钙化,免疫组织化学染色、Real-time PCR和Western blot评价a-SMA、 OPN、 Cbfα1、Klotho和DNMT1基因mRNA和蛋白的表达水平。同时利用焦磷酸测序方法检测胸主动脉Klotho基因甲基化率和超高效液相色谱检测技术检测血清IS浓度。结果：IS组胸主动脉IMT和血管管壁厚度/血管直径显著高于对照组(0.21±0.03mm vs.0.14±0.02mm, P<0.05) (0.34±0.19 vs.0.22±0.07, P<0.05), 对照组2例(25%)茜素红钙盐沉积染色阳性,IS组8例(100%)阳性,IS组阳性率显著高于对照组(P<0.01)。IS组胸主动脉a-SMA蛋白表达水平较对照组显著下调,IS组胸主动脉Cbfα1蛋白表达水平较对照组显著上调。IS组胸主动脉Klotho甲基化率较对照组显著升高(29±5% vs.6±2%,P<0.001),IS组胸主动脉Klotho蛋白表达水平较对照组显著下调,DNMT1蛋白表达水平较对照组显著上调。5-氮杂脱氧胞苷干预后,IS+5-Aza-2dc组胸主动脉IMT和血管管壁厚度/血管直径显著低于IS组(0.21±0.03 mm vs.0.15±0.05mm, P<0.05) (0.34±0.19 vs 0.23±0.09, P<0.05),茜素红钙盐沉积染色5例(62.5%)阳性,显著低于IS组(P<0.01)。IS+5Aza-2dc组胸主动脉a-SMA蛋白表达水平较IS组显著上调,Cbfα1蛋白表达水平较IS组显著下调,与对照组无差异。IS+5Aza-2dc组胸主动脉Klotho甲基化率较IS组显著降低(11±2% vs.29±5%,P<0.01),与对照组无显著差异,且Klotho蛋白表达水平较IS组显著上调,与对照组无差异。结论：硫酸吲哚酚可诱导尿毒症大鼠血管钙化,并可通过上调血管局部DNMT11的活性诱导Klotho超甲基化,下调Klotho蛋白表达水平,阻断Klotho超甲基化可减轻硫酸吲哚酚诱导的尿毒症大鼠血管钙化。