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目的：miRNA-17-92基因簇与许多肿瘤密切相关,通过转录后基因沉默效应调控多种抑癌基因或是癌基因的表达,因此在不同的肿瘤中起抑癌基因或是癌基因的作用。在膀胱癌中E2F3基因被认为是癌基因,但对miR-17-92基因簇的研究较少。我们期望通过研究miR-17-92基因簇产物miR-17-5p、miR-20a在膀胱癌中的表达情况,论证E2F3基因与miR-17-5p、miR-20a之间是否存在调控环路,并进一步研究该调控环路在膀胱癌形成、肿瘤的恶性分化过程中作用。对E2F3与miR-17-5p、miR-20a之间的调控环路的研究可能为膀胱癌发病机制研究和膀胱癌生物治疗带来突破。同时可为膀胱肿瘤提供一个全新的肿瘤标记物,对膀胱癌的诊断和预测将有重要临床价值。方法：本实验共有三部分：第一部分收集膀胱全切或部分切除术新鲜标本,提取总RNA,荧光定量RT-PCR法检测miR-17-5p、miR-20a和E2F3的表达,评估miR-17-5p、miR-20a和E2F3的表达和病理分级的关联；Western blot检测不同病理分级癌组织中E2F3蛋白的表达；检测膀胱癌细胞株T24和5637中,miR-17-5p、miR-20a和E2F3的表达,选择敏感细胞株进行下一步试验。第二部分检测过表达和敲低(knock-down)E2F3对膀胱癌细胞miR-17-5p和miR-20a的影响。1.膀胱癌细胞株转染pcDNA3.1-HA-E2F3质粒,E2F3过表达后,荧光定量RT-PCR法检测miR-17-5p、miR-20a变化、并用Western:blot检测E2F3蛋白的表达,MTT法绘制细胞生长曲线,检测E2F3过表达对细胞生长影响。2.膀胱癌细胞株转染pAAv-RiE2F3-GFP,E2F3敲低后,Western blot检测E2F3蛋白的表达,miR-17-5p、miR-20a的变化用荧光定量RT-PCR检测,流式细胞仪检测对凋亡和细胞周期的影响。MTT法绘制细胞生长曲线,检测E2F3敲低对细胞生长影响。第三部分检测miR-17-5p、miR-20a的拟似物(mimics)和其相应的AMO (anti-miRNA oligonucleotide)对膀胱癌细胞E2F3表达的影响。用miR-17-5p、 miR-20a和其相对的AMO (anti-miRNA oligonucleotide),转染膀胱癌细胞株。荧光定量RT-PCR法分析E2F3在mRNA水平的变化,Western blot检测E2F3蛋白的表达变化,MTT法绘制细胞生长曲线,检测miR-17-5p. miR-20a和其相对的AMO对细胞生长影响。结果：1.膀胱移行细胞癌组织中E2F3的nRNA和蛋白表达水平相对正常组织明显增高(P<0.05),而且随着病理分级的升高,E2F3的mRNA和蛋白表达水平也逐步升高：G3>G2>G1,但各病理分级之间的差异无统计学意义,P>0.05。2.膀胱移行细胞癌组织中miR-17-5p和niR-20a相对正常组织明显增高(P<0.05),而miR-20a随病理分级的升高有降低的趋势：G3<G2<G1,但各病理分级之间的差异无统计学意义,P>0.05。3.相对正常膀胱粘膜,膀胱移行细胞癌5637和T24细胞系中E2F3、miR-17-5p和miR-20a都明显高表达(P<0.05)。E2F3的mRNA及蛋白水平在5637细胞株中的表达明显高于T24细胞株(P<0.05),miR-17-5p和miR-20a的表达也高于T24细胞株,但统计学差异不明显(P>0.05)。4.转染pcDNA3.1-HA-E2F3质粒过表达E2F3后,miR-17-5p和miR-20a也随之明显上调,经MTT法证实对肿瘤细胞的生长有促进作用；转染pAAv-RiE2F3-GFP质粒敲低E2F3后,miR-17-5p和miR-20a则明显下调,MTT法证实对肿瘤细胞的生长受到抑制。5.共转染miR-17-5p和miR-20a的nimics后,E2F3的mRNA水平下调,E2F3的蛋白质表达明显下调(P<0.05),经MTT法证实对肿瘤细胞生长有抑制作用；共转染miR-17-5p和niR-20a的AMO后,E2F3的mRNA水平上调,E2F3的蛋白质表达也明显上调,MTT法证实对肿瘤细胞的生长有促进作用。而单独的miR-17-5p、 miR-20a和其AMO不能影响E2F3的mRNA表达水平,但可以调节E2F3蛋白的表达(P<0.05),可影响肿瘤细胞生长。结论：膀胱移行细胞癌中miR-17-5p、miR-20a和E2F3均高表达。E2F3可促进肿瘤细胞生长,miR-17-5p和miR-20a共同作用可以下调E2F3的mRNA和蛋白表达水平,进而抑制肿瘤细胞的生长。E2F3过表达可刺激上调miR-17-5p和miR-20a的表达水平,E2F3被敲低后,miR-17-5p和miR-20a的表达水平也随之下调。E2F3、miR-17-5p和miR-20a在膀胱移行细胞癌中维持一定水平,形成了一个调节环路,彼此制约,协调膀胱肿瘤细胞的生长。