研究背景与目的:难治性疾病的中药疗效、机制与安全性研究是面向国家对中药新药创制的重大战略需求,也是必须尽快破解的中医药科技与产业瓶颈之一。作为全世界公认的高度恶性肿瘤,胰腺癌（Pancreatic Cancer,PC）起病隐匿,几乎无临床指征,病情进展迅速,大部分患者就医时已属晚期或发生病灶转移,无法实施手术切除治疗。作为胰腺癌治疗的金标准与基础方案,抗核苷酸代谢药物吉西他滨（Gemcitabine,GEM）广泛用于不可切除胰腺癌的姑息化疗与可切除胰腺癌的术后辅助化疗。然而,吉西他滨单药客观缓解率不足10%,是胰腺癌转移性进展与治疗失败的重要原因。因此,在吉西他滨治疗的基础上,深入研究并发现安全合理的吉西他滨增效剂成为胰腺癌治疗的重大临床需求之一。为了维持基因组稳定性,正常细胞启动DNA损伤应答（DNA damage response,DDR）迅速修复受损的DNA。放化疗在一定程度上会损伤肿瘤细胞的DNA而杀死增殖中的肿瘤细胞。为了逃避死亡,肿瘤对DDR的依赖性增强并产生放化疗抵抗。利用这一特性,阻断DDR是提高肿瘤放化疗疗效的一个重要策略。DDR是一个复杂的信号转导网络系统,通过感知DNA损伤并将损伤信号向下游传递,进而引起一系列的生物应答反应,包括细胞周期检查点监控与DNA损伤修复。细胞周期检查点激酶1（Checkpointkinase 1,Chkl）,一种丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶,是损伤传递的主要效应器。Chk1是一个极具吸引力的DDR靶点:（1）几乎参与所有周期检查点监控;（2）稳定复制叉结构。细胞遇到复制压力或损伤时,Chk1通过停顿复制叉并维护复制叉结构的稳定,有利于后期修复并解除基因组不稳定性;（3）正向调控BRCA1/2和RAD51等同源重组（Homologous recombination,HR）修复关键分子向损伤部位加载,从而促进DNA损伤修复。因此,抑制Chk1可以破坏复制叉结构、阻断HR修复,最终导致肿瘤细胞发生严重的DNA双链断裂损伤,从而增强吉西他滨敏感性。湿毒、热毒及湿热毒邪互结是胰腺癌中医病机的关键,而藤类中药尤擅长除风祛湿,活血通络,清热解毒。南蛇藤（Celastrus orbiculatus Thunb.）属卫矛科南蛇藤属落叶藤状灌木或藤本植物,又名过山枫,在中国分布广泛;藤茎可入药,是我国重要的药用植物。本课题组对南蛇藤抗肿瘤的物质基础与药理药效进行了十多年的系统研究,证实南蛇藤提取物对胃癌、肝癌等多种消化道肿瘤细胞具有显著的抗肿瘤活性。课题组进一步对南蛇藤活性部位优化提取工艺、成分分离、结构鉴定及活性分析,从南蛇藤乙酸乙酯部位获得有效组分——南蛇藤总萜（Total Terpenoids of C.orbiculatus,TTC）。本论文拟推进以活性组分为基础的南蛇藤总萜抗胰腺癌的中药现代化研究与开发,将系统回答南蛇藤总萜能否通过抑制DDR关键信号通路增强胰腺癌对吉西他滨的化疗敏感性。因此,本论文旨在明确南蛇藤总萜在体内外胰腺癌模型中增强吉西他滨的抗肿瘤活性,并定量评价二者药理学协同作用;探究南蛇藤总萜通过靶向Chk1/RAD51介导的DNA损伤修复增强胰腺癌细胞对吉西他滨化疗敏感性的分子机制,为南蛇藤总萜作为天然DDR抑制剂并开发安全有效的吉西他滨增敏剂提供实验依据。研究内容与方法:本论文的研究内容分为三个部分:第一部分,通过高效液相色谱、核磁共振与质谱对南蛇藤总萜的化学成分进行表征,选取AsPC-1与BxPC-3胰腺癌细胞株,利用MTT细胞活力实验、EdU增殖实验研究南蛇藤总萜、二萜、三萜单体的体外抗肿瘤活性。利用彗星电泳、中期染色体铺展实验研究南蛇藤总萜对肿瘤DNA双链断裂损伤作用。利用蛋白质免疫印迹实验研究南蛇藤总萜对Chk1/RAD51等损伤应答与修复通路的影响。最终明确南蛇藤总萜通过抑制胰腺癌HR修复、增强DNA损伤从而发挥抗肿瘤作用第二部分,利用Combenefit定量药理学软件分析南蛇藤总萜与吉西他滨的协同作用;利用单细胞克隆形成实验、EdU增殖实验与Annexin V/PI细胞凋亡实验研究南蛇藤总萜协同吉西他滨的体外抗肿瘤活性。利用蛋白免疫印迹实验研究南蛇藤总萜和/或吉西他滨对Chk1/RAD51等损伤应答与修复通路的影响。慢病毒构建mCherry红色荧光BxPC-3细胞,建立原位异种移植瘤小鼠模型,研究南蛇藤总萜协同吉西他滨的体内抗肿瘤活性与安全性。最终明确南蛇藤总萜通过逆转吉西他滨激活Chk1介导的DNA损伤应答与HR修复、增强胰腺癌细胞DNA损伤从而发挥吉西他滨增敏作用。第三部分,利用蛋白质合成抑制剂cycloheximide与蛋白质泛素蛋白酶体通路抑制剂MG132等,结合蛋白免疫印迹实验,研究南蛇藤总萜对Chk1、RAD51以及p53蛋白稳定性的调控模式。对天然缺失野生型p53蛋白的AsPC-1瞬时转染三种热点突变型p53（R175H、R248W、R273H）,研究突变p53对Chk1/RAD51信号路通的影响与南蛇藤总萜的干预作用。最终回答南蛇藤总萜通过靶向DDR关键信号分子Chk1/RAD51增敏吉西他滨的分子机制。研究结果:第一部分:实验发现南蛇藤总萜和二萜、三萜单体对AsPC-1、BxPC-3细胞有一定的细胞毒作用,但同样剂量下对正常细胞系GES-1（胃黏膜上皮细胞）的毒性较弱;彗星实验、中期染色体铺展实验证实南蛇藤总萜能增加胰腺癌细胞DNA双链断裂损伤和染色体结构异常,细胞总活性氧水平检测排除了南蛇藤总萜对DNA的氧化性损伤;蛋白质免疫印迹实验表明南蛇藤总萜降低了 Chk1、同源重组修复相关蛋白RAD51的表达,促进了 DNA双链断裂损伤标志物γH2AX的积累。第二部分:通过Combenefit药物协同定量分析发现南蛇藤总萜联合吉西他滨在亚IC50下产生协同效应;EdU实验结果说明在吉西他滨作用下,加入南蛇藤总萜能进一步阻断G1/S期,抑制胰腺癌细胞的增殖;凋亡实验证明南蛇藤总萜联合吉西他滨引起的胰腺癌细胞的凋亡水平明显增加;同时,蛋白质免疫印迹实验证实南蛇藤总萜逆转吉西他滨介导的DNA损伤应答与修复蛋白Chk1/RAD51的活化。小鼠胰腺癌原位异种移植瘤证实南蛇藤总萜联合吉西他滨治疗能抑制胰腺癌细胞生长,并减轻吉西他滨的肝脏毒性。第三部分:分子机制研究证实南蛇藤总萜通过增加蛋白酶体泛素化降解途径降低Chk1、RAD51表达水平。此外,南蛇藤总萜抑制突变p53的表达的同时也抑制了突变p53诱导的Chk/RAD51信号的活化。研究结论:综上,南蛇藤总萜能增加胰腺癌细胞DNA双链断裂损伤和染色体断裂,进而抑制增殖并诱导凋亡,通过泛素化蛋白酶体降解途径抑制DNA损伤修复相关蛋白Chk1、RAD51表达,对突变p53的胰腺癌细胞具有抑制作用。同时,南蛇藤总萜联合吉西他滨使用可抑制体内胰腺癌瘤体生长和转移,并显示一定的体内安全性;体外研究中南蛇藤总萜能通过逆转复制应激、增加凋亡水平增强吉西他滨疗效。以上研究对理解南蛇藤总萜如何参与DNA损伤和修复,并增加胰腺癌对吉西他滨化疗敏感性机制提供了实验基础,为研究南蛇藤总萜作为天然的Chk1/RAD51通路抑制剂以及吉西他滨增敏剂提供了一定的实验依据。