免疫应答是机体免疫系统受抗原刺激后所发生的以排除抗原为目的的生物学效应过程。按照免疫应答识别的特征、获得形式以及效应机制,可以分为固有免疫和适应性免疫应答两大类。固有免疫,也称为天然免疫或非特异性免疫,是机体在种系发生和进化过程中所形成的天然免疫防御功能,建立了机体抵挡病原微生物感染的第一道防线,并参与适应性免疫应答的启动和调节。固有免疫细胞是固有免疫的一个重要组成部分,有吞噬细胞、树突状细胞和NK细胞等等。单核-吞噬细胞系统,它包括骨髓前单核细胞、外周血单核细胞以及组织巨噬细胞(macrophage,M?)。其中,巨噬细胞是体内具有最活跃的生物学活性的细胞类别之一,其参与机体免疫防御和免疫自稳,能加工和提呈抗原,调节免疫应答以及介导炎症反应等。模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)是一类主要表达于固有免疫细胞表面或胞内器室膜上,能够识别一种或多种病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的识别分子,其通过对PAMPs的识别作用,进而活化相关的信号通路,诱导一系列免疫炎症反应的发生。但是,常常恰好是因为这些模式识别受体的过度活化,导致了一系列自身免疫性疾病的发生,如类风湿关节炎、银屑病以及系统性红斑狼疮等等。重要的PRRs有甘露糖受体、NOD样受体和Toll样受体等,其中,Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一种研究最多且最占据代表性的,且主要表达于树突状细胞、巨噬细胞等抗原递呈细胞(antigen-presenting cell,APC)上的跨膜蛋白,它能特异性地识别结合病毒、真菌、细菌以及寄生虫特定的组成成分,如脂多糖、肽聚糖、细菌DNA、双链RNA等等。TLRs通过介导MyD88依赖型途径和TRIF依赖型途径的活化以诱导机体炎症反应的发生,从而清除外来病原体。除TLR3是通过TRIF通路外,其余全部的TLRs都可利用MyD88作为衔接分子激活下游信号通路,导致大量炎症因子如TNF-α、IL-6和干扰素的释放。随着广泛而深入的研究发现,TLRs在激活固有免疫应答的过程中扮演着越来越重要的角色。虽然TLRs介导的前炎症反应是固有免疫的基本形式,事实上,病原体PAMPs往往同时激活多种TLRs,导致叠加、协同或拮抗等不同的免疫效应,众多研究也表明了TLRs信号通路的相互作用在维持机体的免疫稳态方面有着重要作用,它们诱发的过度免疫炎症反应常常也会导致免疫系统调节功能出现紊乱。然而,TLRs它们各自在此相互协调过程中所扮演的角色及背后的机制仍然不清楚。其次,TLRs再应答是机体再一次接触病原体时发生的免疫应答反应,研究发现,当宿主细胞发生再应答反应时,常常会表现出时强时弱的免疫效应,近年来,以免疫记忆和免疫耐受来解释这些不同的固有免疫行为的观点也越来越多,其背后的机制至今也仍然不清楚,因此,该问题成为了近年来的研究热点。在本论文中,我们采用小鼠Raw264.7巨噬细胞作为研究对象,从巨噬细胞免疫再应答的特征入手,利用TLRs(TLR3、TLR4、TLR7/8、TLR9)配体预先处理巨噬细胞,然后再交叉使用这些不同TLRs的配体刺激该细胞,从而构建再应答模型,在此基础上,观察TLRs再度活化后,巨噬细胞的免疫应答效应改变及其细胞活性变化等状况。首先,本研究中采用不同浓度的TLRs激动剂,包括Poly(I:C)(TLR3激动剂)、CpG-1826(TLR9激动剂)、R848(TLR7/8激动剂)和LPS(TLR4激动剂),分别作用小鼠Raw264.7细胞,从而找到了这些TLRs激动剂的饱和刺激浓度。随后我们利用MTT法和流式细胞术分别检测这些饱和刺激浓度对巨噬细胞的活性和凋亡情况的影响,实验结果发现其影响不大。然后,由于TLR9和TLR7/8都依赖MyD88信号通路激活下游信号传导,我们利用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测不同浓度的TLR9激动剂CpG-1826或饱和浓度的TLR7/8激动剂R848预处理后的Raw264.7细胞再次接受CpG-1826、R848的刺激作用时,细胞上清中炎症因子的释放量变化,从而研究MyD88信号通路的预活化对巨噬细胞二次免疫应答能力的影响。结果发现该细胞的免疫应答能力随预处理浓度的增加而降低;而当预处理细胞再次接受TLR3激动剂Poly(I:C)刺激时,细胞免疫应答能力没有降低,反而有所增强。为了进一步验证这个结果,我们通过免疫印迹试验法(western blot)检测了TLR7/8和TLR9依赖的MyD88信号途径下游IRAK蛋白在再应答中的表达量变化,发现IRAK蛋白的表达量在经过预处理作用后显著下降。我们也检测了经MyD88依赖性TLRs激动剂预处理的细胞间隔一定时间后再次接受刺激作用的情况,发现巨噬细胞的免疫应答能力已难以恢复至初始状态。同样的,由于TLR3只依赖TRIF信号通路激活下游信号传递,我们也利用ELISA法检测了不同浓度的TLR3激动剂Poly(I:C)预处理后的Raw264.7细胞再次交叉使用CpG-1826、R848、Poly(I:C)刺激作用后其细胞上清中炎症因子释放量变化,以研究TRIF通路的预活化对巨噬细胞二次免疫应答能力的影响。结果有趣的是,该预处理作用后的细胞其免疫应答能力都增强。其次,由于TLR4可以同时活化MyD88和TRIF两条信号途径,我们也利用不同浓度的TLR4激动剂LPS预处理Raw264.7细胞以研究TLR4活化对巨噬细胞二次免疫应答能力的影响,结果发现,当该细胞接受CpG-1826、R848以及LPS这三种激动剂的刺激作用时,细胞免疫应答能力都降低;相反的是,经Poly(I:C)再次刺激的细胞其免疫应答能力却显著增强,这说明MyD88通路的预活化降低了其自身介导的二次反应,而TRIF通路的预活化能增强随后巨噬细胞的二次反应,并且无论是TRIF通路本身还是MyD88通路被再次激活,巨噬细胞的免疫反应都得到了增强。以上结果显示,经不同TLRs活化的巨噬细胞表现出不同的二次应答能力,与激活的通路密切相关。有趣的是,我们利用光学电子显微镜观察了不同TLRs活化后的细胞形态学变化,也发现了一致的相关性,当MyD88通路活化后,巨噬细胞变大,伪足伸长,胞质物增多,当预处理细胞接受二次刺激时,细胞形态不再继续变大和肿胀;而TRIF通路活化后的细胞其形态与正常细胞基本一致。综合以上结果,这表明,不同TLRs所表现出来的反应可归为两类,一种是再应答时的增强,另一种是再应答时的减弱,而这两类不同的反应特征与其依赖的信号通路有关。其中,MyD88通路介导的反应是迅猛的,饱和攻击使细胞肿胀到达极限,导致巨噬细胞资源被消耗,其免疫应答能力短时间内难以恢复到正常水平,从而再应答时表现出非特异性的免疫无能。其次,MyD88通路的活化虽然导致自身的再应答无能,但却不影响TRIF通路的反应性,这再现了TLRs信号通路的独立性。相反的,TRIF通路的活化没有使细胞发生过度的反应,即使是饱和攻击,细胞形态也没有发生肿胀,而且TRIF通路的活化还会增强自身以及MyD88通路的再应答能力,从而体现了非特异性的激惹特征。本研究不仅使我们对TLRs两条信号通路在固有免疫中扮演的不同角色以及TLRs之间的相互作用有了更深的认识,也为未来固有免疫调控提供了新的思路。