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目的:近年研究表明Lyn激酶在哮喘的气道高分泌中有重要作用,但其具体机制尚不明确。本实验主要研究Lyn激酶对气道上皮细胞MUC5AC表达的影响及其相关作用机制。方法:第一部分细胞实验:(1)pLV.Ex3d.P/puro-EF1A-hLYN-eGFP(Lyn+)病毒的构建:该部分为赛业生物科技公司完成(略)。(2)用35mm直径培养皿培养人支气管上皮细胞(16HBE)细胞共6盘,3盘用pLV.Ex3d.P/puro-EF1A-hLYN-eGFP(Lyn+)病毒感染,剩余的用pLV.Ex2d.P/puro-EF1A-eGFP(Lyn-)病毒感染,感染复数(MOI)为10,每组内再设对照,IL-4,IL-13三个小组,病毒感染48小时后分别用终浓度为1ng/ml的IL-4,IL-13刺激细胞,对照组不处理,刺激24小时后用细胞裂解液提取蛋白,Western-blot检测16HBE细胞中Lyn、STAT6、pSTAT6的表达情况。(3)用共聚焦培养皿培养16HBE 共 6 盘,3 盘用 pLV.Ex3d.P/puro-EF1A-hLYN-eGFP(Lyn+)病毒感染,剩余的用pLV.Ex2d.P/puro-EF1A-eGFP(Lyn-)病毒感染,感染复数(MOI)为10,每组内再设对照,IL-4,IL-13三个小组,病毒感染48小时后分别用终浓度为1ng/ml的IL-4,IL-13刺激细胞,对照组不处理,刺激24小时后用免疫荧光法检测16HBE中MUC5AC的表达情况。第二部分动物实验:6-8周,野生型C57BL/6雌性小鼠(Wide Type,WT)16只随机分为对照组、哮喘组,每组8只;6-8周,Lyn激酶高表达转基因C57BL/6雌性小鼠(Lyn+)16只随机分为对照组、哮喘组,每组8只。哮喘组用卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)腹腔注射致敏、鼻腔滴入激发,对照组接受同等剂量的生理盐水。在末次激发24小时后行肺泡灌洗并对其中细胞分类计数,肺组织行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色,Masson’ s 染色和过碘酸-希夫(Periodic Acid-Schiff,PAS)染色,免疫荧光法检测MC5ACC、免疫印迹(Western Blot)法测定 STAT6、pSTAT6、Lyn,ELISA 法检测小鼠肺组织中IL-4、IL-13、IL-17的表达情况。结果:1、细胞实验:(1)pLV.Ex3d.P/puro-EF1A-hLYN-eGFP 病毒测序所得序列与人Lyn序列进行比较,提示构建病毒序列与预计碱基序列完全吻合。(2)western-blot显示Lyn高表达病毒感染细胞后,STAT6、pSTAT6表达减少。(3)免疫荧光显示Lyn高表达病毒感染细胞后,MUC5AC表达减少。2、动物实验:(1)BALF中细胞学情况:Lyn+哮喘组的白细胞总数、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的比例明显比WT哮喘组低(P<0.05)。(2)小鼠肺组织病理变化:HE染色显示WT哮喘组有大量炎症细胞浸润于支气管、血管周围及周围肺组织,上皮细胞有坏死脱落,杯状细胞增生,Lyn+哮喘组与之相比炎症明显减轻;Masson’ s可见与WT哮喘组相比Lyn+哮喘组平滑肌细胞增生明显减轻;PAS染色显示WT哮喘组支气管有大量的糖蛋白表达,Lyn+哮喘组有少量表达,而对照组极少表达;免疫荧光法可见WT哮喘组MUC5AC荧光强度最高,气道内黏液分泌较多,Lyn+哮喘组与之相比明显减轻,而对照组最低。(3)western-blot:哮喘组的STAT6、PSTAT6表达水平明显高于对照组,而Lyn+哮喘组又比WT哮喘组表达水平低。(4)ELISA检测肺组织的IL-4、IL-13、IL-17水平:哮喘组明显高于对照组,而Lyn+哮喘组又低于WT哮喘组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、细胞实验:Lyn激酶在一定程度上能减轻IL-4、IL-13诱导人支气管上皮细胞分泌MUC5AC,其作用机制可能是通过下调STAT6来调节MUC5AC的表达。2、动物实验:OVA反复刺激能诱发小鼠的气道炎症反应,引起支气管黏液分泌,从而出现哮喘症状,而Lyn激酶可缓减该作用,其作用机制可能是通过下调STAT6信号通路的信号传导作用来实现对小鼠的气道炎症反应减缓和对支气管黏液分泌的抑制。