研究背景溃疡性结肠炎（UC）是一类发生在结直肠的慢性炎症性疾病,常见症状为腹痛、腹泻和血便等。炎症反应、胆汁酸和肠道菌群紊乱、焦亡和凋亡的激活在UC的发展中发挥了重要的作用。虽然我们对UC的发病机制有了初步的了解,但目前仍无特效的预防和治疗药物,且已有的药物在临床治疗过程中均具有比较严重的副作用,因此亟待寻找新的、安全且高效的防治策略。苹果多酚提取物（APE）是从新鲜苹果中提取的植物化学物的混合物,研究提示其具有抗炎、抗氧化作用,已有研究也表明其含有的单体成分根皮素能够明显改善葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的急性UC。由于肠道内环境的复杂性,组合成分相比于单一成分应该更能有效地维持肠道健康。膳食来源的多酚混合物不仅符合食物的天然构成,而且可以更真实的反映我们的饮食情况,更具有实际的应用价值,但关于植物化学物混合物APE和急性UC的研究甚少。因此,本论文拟探讨不同剂量的APE干预对急性UC的预防作用及可能机制,以期为急性UC的防治提供实验数据支持。目的:以DSS诱导的急性UC小鼠为模型,第一部分从炎症反应、胆汁酸代谢和肠道菌群角度探讨APE对急性UC的预防作用;第二部分从焦亡和凋亡角度进一步探讨APE对急性UC的预防作用。方法:一.第一部分60只6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠在SPF动物房适应性喂养一周后,随机分为对照组（CON）、模型组（DSS）、100 mg/（kg·bw·d）根皮素组（PT）、500 mg/（kg·bw·d）APE 组（HAP）、125 mg/（kg·bw·d）APE+DSS 组（LD）、500 mg/（kg·bw·d）APE+DSS组（HD）和 100 mg/（kg·bw·d）根皮素+DSS 组（PD）。其中 PT 组、HAP 组、LD 组、HD组和PD组给予相应剂量的APE或根皮素灌胃21 d,CON组和DSS组则给予相同体积的双蒸水灌胃21d。同时,在第15-21 d,DSS组、LD组、HD组和PD组小鼠饮水中加入3%DSS制备急性UC模型。造模期间,每天称量小鼠体重,测粪便隐血和粪便粘稠度进行疾病活动指数（DAI）评分。干预结束后,将小鼠禁食过夜并安乐处死,取肝脏、脾脏、回肠、结肠和肠道内容物。记录结肠长度和脾脏重量。Western Blot检测结肠组织中核因子κB（NF-κB）炎症通路和肠道紧密连接相关蛋白的表达。实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（RT-qPCR）法检测结肠组织中促炎症因子和肝脏、回肠中与胆汁酸合成相关蛋白质的mRNA水平。免疫荧光法用于检测结肠组织中p65的入核情况。超高效液相色谱（UPLC）检测盲肠内容物中胆汁酸成分。利用16S rDNA高通量测序检测盲肠内容物中肠道菌群构成。二.第二部分为进一步探讨APE对急性UC的预防作用,取以下5组:CON组、DSS组、HAP组、LD组和HD组,使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定血清中C-反应蛋白（CRP）、白介素1β（IL-1β）、白介素18（IL-18）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。取结肠进行Western Blot、RT-qPCR和TUNEL染色实验,确定各组小鼠焦亡和凋亡水平。此外,使用RT-qPCR测定下丘脑、海马和皮质中环氧化酶-2（Cox-2）和神经胶质纤维酸性蛋白（Gfap）的mRNA表达水平。结果:一.第一部分1.小鼠DAI评分,结肠长度和脾脏重量与CON组相比,DSS组DAI评分和脾脏重量显著上升、结肠长度显著缩短。与DSS组相比,LD组脾脏重量显著下降;HD组DAI评分和脾脏重量显著下降,结肠长度显著增加;PD组结肠长度显著增加。LD组、HD组和PD组相比,DAI评分和结肠长度无统计学差异。与PD组相比,LD组和HD组脾脏重量显著下降。2.结肠组织病理学以及肠道紧密连接蛋白CON组、PT组和HAP组小鼠结肠组织病理学检查未见明显异常。DSS组小鼠结肠组织黏膜层损伤,上皮细胞脱落,结缔组织增生,且存在淋巴细胞、粒细胞等炎性细胞浸润的现象。与CON组相比,DSS组结肠组织病理学评分显著升高。与DSS组相比,LD组结肠组织病理学评分显著下降。CON组和DSS组咬合蛋白（Occludin）和闭合小环蛋白1（ZO-1）的蛋白表达水平无统计学差异。与DSS组相比,HD组和PD组Occludin蛋白水平显著上升,但HD组和PD组之间的差异无统计学意义。3.NF-κB通路相关指标DSS组小鼠结肠组织中p65、p-p65、IκB激酶β（IKKβ）和核转录因子κB抑制蛋白α（IκBα）的蛋白表达水平,p65核阳性率和白介素6（Il-6）mRNA表达水平相比于CON组均显著升高。与DSS组相比,LD组小鼠结肠组织中p-p65蛋白表达水平和Il-6mRNA水平显著降低;HD组p65、IKKβ、p-p65的蛋白水平以及p65的核阳性率和Il-6 mRNA水平均显著降低;PD组IKKβ蛋白水平和Il-6 mRNA水平显著降低。LD组、HD组和PD组相比,NF-κB通路相关指标均无统计学差异。4.小鼠肠道内容物中胆汁酸水平DSS组小鼠肠道内容物中总胆汁酸水平显著下降,根皮素干预有抑制总胆汁酸水平下降的作用。与DSS组相比,HD组亲水性胆汁酸相对水平有上升趋势,LD组和PD组亲水性胆汁酸相对水平有下降趋势,但均无统计学差异。与CON组相比,DSS组小鼠肠道内容物中β-鼠胆酸（β-MCA）相对水平显著下降,猪去氧胆酸（HDCA）相对水平显著上升。与DSS组相比,HD组小鼠肠道内容物中β-MCA相对水平显著上升,HDCA相对水平显著下降;PD组小鼠肠道内容物中HDCA相对水平显著下降。HDCA相对水平在HD组和PD组之间的差异不具有统计学意义。5.肝脏和回肠中与胆汁酸合成相关蛋白质的mRNA水平肝脏组织中,与CON组相比,DSS组胆固醇7α-羟化酶（Cyp7a1）、法尼酯X受体（Fxr）和肝脏受体同源物-1（Lrh-1）mRNA水平显著上升,小异质二聚体伴侣（Shp）和β-klotho mRNA显著下降。与DSS组相比,LD组Lrh-1 mRNA水平显著下降,Shp和β-klotho mRNA水平显著上升;HD组Cyp7a1、Fxr、Lrh-1和肝脏FGF受体4（Fgfr4）mRNA水平显著下降,Shp和β-klotho mRNA水平显著上升;PD组Cyp7a1、Fxr、Lrh-1和Fgfr4 mRNA水平显著下降,Shp mRNA水平显著上升。上述指标在LD组、HD组和PD组之间的差异不具有统计学意义。回肠组织中,与CON组相比,DSS组成纤维细胞生长因子15（Fgf15）mRNA水平显著下降;与DSS组相比,HD组PD组Fgf15mRNA水平显著上升,而HD组和PD组相比,差异无统计学意义。6.小鼠肠道内容物中肠道菌群结构Chaol指数和Shannon指数在CON组和DSS组之间无统计学差异。与DSS组相比,LD组和PD组Shannon指数显著降低。拟杆菌门、疣微菌门和厚壁菌门为门水平上的优势菌门。在属水平上,Muribaculaceae-unclassified、Akkermansia、Alistipes和Bacteroides为优势菌属。在门水平上,APE干预显著增加疣微菌门的丰度,降低拟杆菌门的相对丰度;根皮素干预显著增加疣微菌门的丰度,降低厚壁菌门的相对丰度。在属水平上,APE干预显著增加了Bacteroides和Akkermansia的相对丰度,同时显著降低Muribaculaceae-unclassified和Alistipes的相对丰度;根皮素干预仅仅显著增加Bacteroides和Akkermansia的相对丰度。7.肠道菌群与胆汁酸的相关性分析β-MCA 与 Alistipes、Ruminiclostridium9、Intestinimonas、Ruminiclostridium、Bilophila、Tyzzeralla、Peptococcus、ClostridialesvadinBB60group 和 Barnesiella呈显著负相关。HDCA 与 Ruminiclostridium9、Intestinimonas、Ruminiclostridium、Bilophila、Tyzzeralla、Peptococcus、ClostridialesvadinBB60group 和 Barnesiella呈显著正相关,与S24-7呈显著负相关。二.第二部分1.血清中促炎症因子的表达水平与CON组相比,DSS组小鼠血清中CRP和IL-1 β水平显著上升。与DSS组相比,LD组小鼠血清中CRP水平显著下降,HD组小鼠血清中CRP和IL-1 β水平显著下降。LD组和HD组之间,CRP表达水平不具有统计学差异。2.结肠中促炎症因子的表达水平PCR结果显示DSS组结肠组织中Il-18的mRNA表达水平相比CON组显著上升。与DSS组相比,APE干预后Il-18的mRNA表达水平显著下降,且LD组和HD组之间的差异无统计学意义。3.焦亡相关指标的表达水平与CON组相比,DSS组小鼠结肠组织中Nod样受体蛋白3（NLRP3）、Caspase-1、Pro-Caspase-11、Caspase-11、GSDMD、GSDMD-N 和 IL-1β的蛋白表达水平显著升高。与DSS组相比,LD组小鼠结肠组织中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和GSDMD-N的蛋白表达水平显著下降;HD组小鼠结肠组织中上述指标的表达水平均显著下降,且LD组和HD组之间的差异均无统计学意义。4.凋亡相关指标的表达水平与CON组相比,DSS组小鼠结肠组织中B细胞淋巴瘤-2（BCL-2）的蛋白表达水平显著降低。与DSS组相比,HD组小鼠结肠组织中BCL-2的蛋白表达水平显著升高。与CON组相比,DSS增加了小鼠结肠中TUNEL阳性细胞的数量,且APE改善了 TUNEL 阳性细胞数量增加的情况。5.神经炎症相关指标的表达水平与CON组相比,DSS组小鼠下丘脑中Cox-2的mRNA表达水平显著上升,海马中Gfap的mRNA表达水平显著上升。与DSS组相比,APE干预组小鼠下丘脑中Cox-2的mRNA表达水平显著下降,海马中Gfap的mRNA表达水平显著下降,且LD组和HD组之间的差异无统计学意义。结论:1.APE和根皮素均可通过抑制炎症通路的激活,保护肠黏膜完整性,调节胆汁酸和肠道菌群达到预防小鼠急性UC的目的。APE抑制NF-κB通路活化和增加胆汁酸亲水性的效果优于根皮素,因此,APE对小鼠急性UC的保护作用优于根皮素。2.APE可通过抑制焦亡和凋亡改善DSS诱导的小鼠急性UC,而且,APE应该可以改善小鼠急性UC相关的脑组织神经炎症。