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前言： 肝内胆管结石是一种主要发生于东亚的地区性疾病，其发病机制仍没有完全研究清楚。既往研究显示慢性增生性胆管炎症是肝内胆管结石的发病因素之一。在炎症过程中，一系列炎症介质的释放可能是肝内胆管结石发病的重要机制。动物实验中发现外源性PGE2能够引起肝内胆管出现类似于胆管炎样的形态改变。而伴有肝内胆管结石的胆管上皮表达更多的COX-2和PGE2。此外，研究发现PGE2能够促进胆管上皮细胞增殖。这些研究提示COX-2/PGE2过度表达参与了慢性增生性胆管炎及肝内结石的发病过程。 慢性增生性胆管炎引起肝内结石的重要原因之一为MUC（粘蛋白的蛋白部分）的过度分泌。研究显示含结石的肝内胆管上皮MUC2和MUC5AC表达显著高于正常肝内胆管上皮，提示MUC2和MUC5AC参与了肝内胆管结石的形成过程。此外，研究人员发现慢性增生性胆管炎伴有肝内胆管结石患者胆汁中含有高水平的磷脂酶A2，同时伴随LPS、PGE2及MUC2和MUC5AC表达增多。综合以上研究结果，我们推测在慢性增生性胆管炎中，COX-2/PGE2可能介导了MUC2和MUC5AC过度分泌，并促进了肝内胆管结石的发病过程。 在本实验中，我们将首次采用体外培养的人类肝内胆管上皮细胞作为研究对象，以LPS作为刺激因素，观察研究COX-2/PGE2在肝内胆管上皮细胞的表达情况，同时检测MUC2和MUC5AC的表达状态。采用COX-2抑制剂及外源性PGE2处理等手段探讨COX-2/PGE2是否介导了MUC2和MUC5AC的表达上调过程，并对其中的信号转导机制进行研究和探索。 材料和方法： 人肝内胆管上皮细胞HIBEC(Human Intrahepatic Biliary Epithelial Cells)及培养液购于美国ScienCell公司;COX-2多克隆抗体购自于武汉博士得公司;TLR4、NFκBp65、EP4多克隆抗体及MUC2、MUC5AC单克隆抗体购自于Santa Cruz公司（美国）;PGE2 ELISA试剂盒购自于Biotrak Amersham公司（英国）;RNAisoReagent和SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit购自于大连宝生物工程公司; TLR4拮抗剂E5564购自美国EB16-Science公司;内毒素、NFκB抑制剂PDTC、EP4抑制剂AH23848、 COX-2抑制剂NS-398和PGE2购自于美国Sigma公司。 CO2培养箱，日本Sanyo公司;LightCycler PCR仪，瑞士Roche Diagnotics公司;全自动酶标仪ST-360，日本KHB公司;5810R低温超速离心机，德国EFFENDORF公司;凝胶自动成像分析系统，美国PERSONALFX公司;UVMINI-1204紫外分光光度计，日本岛津公司;MDF-U32V深冻冰箱，日本Sanyo公司等。 采用RNAiso reagent进行RNA提取;RNA检测采用real-time PCR技术;蛋白检测采用Western blot技术;细胞上清液中蛋白检测采用Elisa法。 两者比较采用studentst检验，不同时间点比较采用单因素方差分析。P＜0.05为有显著性差异。采用SPSS11.5软件进行统计学处理。 结果： 1、COX-2和PGE2在人肝内胆管上皮细胞中的表达及LPS对其表达的诱导作用。 人肝内胆管上皮细胞内存在较弱的COX-2蛋白表达。在经LPS作用后，COX-2蛋白和mRNA表达均显著增加(P＜0.01)，其中在6小时后增加最为显著，COX-2mRNA表达水平增加到基础表达的24.6倍。人肝内胆管上皮细胞经LPS(1μg/ml)作用后，细胞上清液中PGE2含量显著增加（P＜0.01）。 2、LPS受体TLR4介导LPS对COX-2/PGE2表达的诱导作用。 人肝内胆管上皮细胞存在TLR4蛋白和mRNA表达，经LPS作用后，TLR4蛋白和mRNA表达水平均升高，其中TLR4 mRNA表达水平升高了3.6倍(P＜0.01)。经TLR4拮抗剂E5564预处理后，然后采用LPS作用人肝内胆管上皮细胞。COX-2 mRNA表达未出现显著增加。同时，细胞上清液中PGE2含量亦未出现显著升高。结果显示LPS对COX-2和PGE2的诱导作用被TLR4拮抗剂E5564抑制。 3、核转录因子NFκB介导LPS对COX-2/PGE2表达的诱导作用。 人肝内胆管上皮细胞核内存在NFκBp65表达，经LPS作用后，NFκBp65表达水平升高。结果显示LPS能够促进NFκBp65向核内移位。经NFκB抑制剂PDTC预处理后，然后采用LPS作用人肝内胆管上皮细胞。COX-2 mRNA表达未出现显著增加。同时，细胞上清液中PGE2含量亦未出现显著升高。结果显示LPS对COX-2和PGE2的诱导作用被NFκB抑制剂PDTC阻断。 4、MUC2在人肝内胆管上皮细胞中的表达及LPS对其表达的诱导作用。 人肝内胆管上皮细胞内存在较弱的MUC2蛋白表达。在经LPS作用后，MUC2蛋白和mRNA表达均显著增加(P＜0.01)，其中在12小时后增加最为显著，MUC2mRNA表达水平增加到基础表达的15.5倍。 5、MUC5AC在人肝内胆管上皮细胞中的表达及LPS对其表达的诱导作用。 人肝内胆管上皮细胞内存在MUC5AC蛋白表达。在经LPS作用后，MUC5AC蛋白和mRNA表达均显著增加(P＜0.01)，其中在12小时后增加最为显著，MUC5AC mRNA表达水平增加到基础表达的26.2倍。 6、LPS受体TLR4介导LPS对MUC2和MUC5AC表达的诱导作用。 经TLR4拮抗剂E5564预处理后，然后采用LPS作用人肝内胆管上皮细胞。MUC2 mRNA及MUC5AC mRNA表达均未出现显著增加。结果显示LPS对MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表达的诱导作用被TLR4拮抗剂E5564抑制。 7、核转录因子NFκB介导LPS对MUC2和MUC5AC表达的诱导作用。 经NFκB抑制剂PDTC预处理后，然后采用LPS作用人肝内胆管上皮细胞。MUC2 mRNA及MUC5AC mRNA表达均未出现显著增加。结果显示LPS对MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表达的诱导作用被NFκB抑制剂PDTC阻断。 8、 PGE2受体EP4在人肝内胆管上皮细胞中的表达及LPS对其表达的诱导作用。 人肝内胆管上皮细胞内存在EP4蛋白和mRNA表达，经LPS作用后，EP4蛋白和mRNA表达水平均升高，其中EP4 mRNA表达水平升高了5.2倍(P＜0.01)。经EP4抑制剂AH23848预处理后，然后采用LPS作用人肝内胆管上皮细胞。MUC2mRNA及MUC5AC mRNA表达均未出现显著增加。结果显示LPS对MUC2 mRNA和MUC5AC mRNA表达的诱导作用被EP4抑制剂AH23848阻断。 9、COX-2抑制剂抑制LPS对MUC2和MUC5AC表达的诱导作用。 经COX-2抑制剂NS-398预处理后，然后采用LPS作用人肝内胆管上皮细胞。MUC2 mRNA及MUC5AC mRNA表达未出现显著增加。结果显示LPS对MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表达的诱导作用可被COX-2抑制剂NS-398抑制。 10、外源性PGE2诱导细胞MUC2和MUC5AC的表达。 采用外源性PGE2作用人肝内胆管上皮细胞，MUC2蛋白和mRNA表达显著升高，其mRNA表达升高17.3倍(P＜0.01)。同时，MUC5AC蛋白和mRNA表达亦显著升高，其mRNA表达升高了21.4倍(P＜0.01)。 结论： 1、LPS可上调人肝内胆管上皮细胞COX-2/PGE2表达，提示COX-2/PGE2途径参与了人肝内胆管炎症过程。LPS受体TLR4及NFκB介导了LPS对人肝内胆管上皮细胞COX-2/PGE2表达的调节过程。 2、LPS可诱导人肝内胆管上皮细胞表达MUC2和MUC5AC，提示肝内胆管炎症能引起MUC2和MUC5AC分泌增多。LPS受体TLR4及NFκB参与了LPS对人肝内胆管上皮细胞MUC2和MUC5AC表达的调节过程。 3、COX-2/PGE2介导了LPS对人肝内胆管上皮细胞MUC2和MUC5AC表达的上调过程。PGE2对MUC2和MUC5AC的调节作用与EP4受体有关。COX-2抑制剂或EP4受体拮抗剂可用于临床来治疗肝内胆道炎症及预防或减缓肝内胆管结石的发病。