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目的:心力衰竭是一种常见的具有较高死亡率的心血管疾病。随着老龄化群体中心血管危险因素增多,导致心力衰竭的患病率也逐年升高。在体外模型中,2D单层细胞培养已研究50年,并为心力衰竭做出了很多成果,然而与传统的二维培养模式相比,3D类器官培养能更好的模拟器官组织的生理及病理状态,且为细胞之间的相互作用提供了适宜的环境。丹参和川芎作为治疗心脑血管疾病的传统中草药已有广泛的研究,但二者合用治疗心力衰竭的研究较少,机制尚未清晰。因此,本研究通过构建了 3D体外心脏类器官模型,探讨了丹参-川芎药对——冠心宁注射液(GXNI)在该心脏类器官体外模型的药效作用,最后通过体内实验使用主动脉弓缩窄术(TAC)模拟心力衰竭疾病的发生发展过程探讨药效及其药理学机制,让实验结果更可靠。本研究有望为心血管疾病提供更加接近体内的类器官体外模型,同时为GXNI的临床应用和处方优化提供理论依据。方法:1.利用原代乳鼠心脏细胞原有比例将其心脏细胞共培养于超低吸附孔板中,自组装聚合形成3D类心脏微球,通过整体微球的免疫荧光以及切片的免疫荧光验证心脏内主要细胞——心肌细胞和成纤维细胞的存在。将5×103、1×104、5×104和1×105密度浓度的心脏细胞分别在1、2、3、7和14天进行观察,再通过免疫荧光观察各细胞的分布以此确定类心脏微球的浓度。接下来通过观察长达34天培养的类心脏形态,以及34天后对其进行免疫荧光的功能指标验证,以此来评判所建立的心脏类器官模型是否成功。2.通过苯肾上腺素(PE)诱导首次建立的体外心脏类器官模型中,形成心脏损伤疾病模型。为确保药物有效性,损伤又不宜过重,所以需要进行不同PE浓度的摸索。通过类心脏的直径、面积判断其细胞肥大的程度、观察不同浓度PE诱导后类心脏的搏动率,同时用荧光染色法观察20、100、500、1000、2000 μmol/L PE诱导对线粒体功能损伤的影响,以此来确定PE诱导的浓度。接下来,为进一步探究PE诱导引起肥大发挥主要作用的细胞,分别提取了心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞进行PE诱导,通过CCK8法和免疫荧光法判断其增殖效率,证明PE诱导的类心脏发生肥大的具体原因。3.探究中药丹参-川芎药对所组成的冠心宁注射液对心脏损伤的影响,通过我们所建立的体外心脏类器官心脏损伤模型进行药效学验证。将原代乳鼠心脏细胞提纯分离成心肌细胞和成纤维细胞,利用CCK8法确定GXNI的给药浓度。通过荧光染色法进行活/死细胞的验证,探究GXNI对心脏损伤引起细胞凋亡的影响,接下来通过形态学观察分析,验证GXNI给药后对心脏肥大的治疗效果,观察心脏直径、面积的变化。通过免疫荧光法验证GXNI对PE诱导后线粒体功能的影响,最后用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步验证心脏损伤导致心脏肥大的基因表达。4.在体内利用TAC构建心力衰竭模型。手术4周后,随机分为模型组(Model)、阳性药美托洛尔组(MeTI)和GXNI治疗组,同时设置假手术组(Sham)。每天进行腹腔注射药物,Sham组和Model组注射等量生理盐水,持续28天。通过体重和血压情况、超声心动学、血流动力学、病理学观察评价GXNI对TAC诱导的心衰的药效作用。5.选取GXNI中剂量组和Model组小鼠的心脏组织进行转录组分析,将获得的差异基因(DEGs)以log2FoldChange ≥ 1和P≤ 0.05进行筛选,联合网络药理学Ingenuity Pathway Analysis(IPA)核心分析,探讨GXNI对心衰小鼠保护作用的关键机制和关键靶标蛋白。通过RT-PCR、免疫印迹法(WB)、免疫组化(IHC)对IPA的结果进行实验验证。接下来,通过之前我们所构建的体外心脏类器官疾病模型进行免疫荧光(IF)对IPA的结果进行体外的机制验证。结果:1.通过原代乳鼠提取的心脏细胞共培养形成类心脏微球,IF进行心脏细胞典型Marker的验证,接下来通过类心脏切片单层的免疫荧光显示出心肌细胞在内而成纤维细胞在外与其紧密结合的分布的情况。通过不同细胞浓度和不同天数的培养,我们发现在初始密度为1×104时,类心脏微球内的细胞分布层次清晰,且球中心氧浓度足够、细胞圆润度较好、类心脏搏动规律。确定浓度后,可以长达34天培养甚至更久,IF发现细胞的排列分布以及细胞的完整度圆润度和培养7天时无显著差异,因此后续实验将在7天后开始实验,接下来通过CD31和Laminin(细胞质外基质的主要成分)的阳性表达,表明类心脏微球内的微血管及细胞质外基质的存在,进一步证明了我们所建立的体外类心脏微球更加符合人体内环境,因此进一步证明心脏类器官的成功建立。2.不同浓度PE诱导后发现,在给予浓度为500μmol/L PE时,类心脏微球的直径有显著的差异性,类心脏发生肥大,且从从500 μmol/L开始均出现了不规律的搏动以及过快或过慢的搏动频率。通过高内涵多细胞成像系统分析,在线粒体功能影响中,PE处理后心脏微球MitoTracker、Rhod-2从500 μmol·L-1浓度开始荧光强度与正常对照组相比明显增强,证明线粒体质量增加,细胞内Ca2+显著升高。Rhodamine 123的荧光强度减弱,表明线粒体膜电位显著降低,与对照组相比均有明显的统计学差异。PE诱导后免疫荧光CD31的高表达以及CCK8吸光度上升表明类心脏微球肥大不仅由心肌细胞肥大产生,也由内皮细胞和成纤维细胞增殖共同引起。3.通过提纯分离发现各细胞纯度达到90%以上,CCK8实验发现GXNI对原代心肌细胞的 IC50=10.57 μL/mL、成纤维细胞的 IC50=11.44 μL/mL,1 μL/mL、3 μL/mL 和 9μL/mL被选为类心脏微球的给药浓度。通过荧光染色活/死细胞实验发现PE诱导后细胞凋亡明显增加,GXNI给药后显著降低死细胞的比例。光镜下进行形态学观察分析,PE诱导后类心脏直径显著增加,不同浓度的GXNI给药后呈现不同的治疗作用,其中1 μL/mL GXNI治疗后,类心脏直径仅有下降趋势,无统计学差异。因此GXNI可以逆转PE的促肥大效应,使微球的直径减小。用荧光染色验证线粒体功能,结果表明GXNI预给药后可以不同程度的降低线粒体质量,减少细胞内钙离子的浓度,减缓钙超载。PCR结果表明,GXNI可以减弱ANP、BNP和/β-MHC的上调。4.在体内,TAC术后4周进行分组,连续给药28天。血压检测发现GXNI可以降低TAC引起的舒张压和收缩压升高。超声心动学检测表明GXNI治疗显著增加了模型组小鼠的EF及FS,降低了 LV vols、LV vold、LVDs和LVDd,增强了心衰小鼠的心脏功能。血流动力学检测结果证明+dp/dtmax和-dp/dtmax在给予不同浓度的GXNI治疗均有显著的上升趋势。H&E和Masson染色发现GXNI可以改善心肌细胞肥大、心肌纤维排列紊乱将少胶原沉积降低心肌纤维化面积。5.在对GXNI和Model组小鼠心脏组织的转录组分析中,获取了 854个log2FoldChange ≥ 1以及P≤0.05的差异表达基因,其中上调和下调基因分别含有414个和440个。通过结合网络药理学,对其854个差异基因进行核心分析,得到排名前10的信号通路,其中与心脏疾病最相关的是第3条成纤维细胞IL-17A通路(IL-17A Signaling in Fibroblasts)。同时以转录组数据里的差异表达基因与心室重构、心脏肥大和心肌纤维化为关键词通过查阅国内外相关文献,找到了与调节心室重构导致心脏肥大和心肌纤维化有关且在转录组里变化倍数较大的基因。它们分别是Adamts4、c-fos、Fosb、Gal、Ccl7、Ccr1、Mmp27、Mmp1和p38。结果证实了 3 mL/mg 的 GXNI 可以显著降低Adamts4、c-Fos、Gal、Ccl7、Mmp1和p38。IHC 和 WB 结果均表明 GXNI 可以显著降低p38、c-Fos和Mmp1的表达水平。同时进一步通过体外心脏类器官IF结果表明GXNI可以显著抑制p38、c-Fos和Mmp1的表达。结论:1.通过将原代乳鼠心脏细胞在低吸附条件下进行共培养自组装形成微球,并通过心脏特性蛋白的表征、生理功能验证、疾病模型模拟,证明具有类似人体内生理功能且可以实现长达34天的长期培养的类器官模型。2.通过3D体外心脏类器官模型和体内TAC模型,均可证明冠心宁注射液可以有效改善心室重构引起的细胞凋亡、心脏肥大和心肌纤维化。3.揭示并验证了 IL-17A Signaling in Fibroblasts 通路中p38/c-fos/Mmp1通路是冠心宁注射液治疗心脏损伤而导致心脏肥大和心肌纤维化的关键通路。