三种人类致病性耶尔森氏菌都含有一个高度保守的毒力质粒(pYV或pCD)，该毒力质粒编码类似于针状注射体结构的Ⅲ型分泌系统(Type three secretion system，T3SS)。当耶尔森氏菌与宿主细胞接触或在体外37℃低钙条件培养时，T3SS被诱导表达。耶尔森氏菌可通过该系统将毒力因子或效应蛋白直接注入宿主细胞内或分泌到胞外。耶尔森氏菌T3SS受到外界环境因子以及毒力质粒和染色体编码蛋白在不同水平的调控，但目前缺乏对T3SS转录调控系统全面的研究。　　本研究以致病性假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）YPⅢ为对象，在系统分析pYV毒力质粒上所有基因启动子活性的基础上，研究了毒力质粒在转录水平上应对温度和钙离子两个环境因素的应答反应过程，同时对T3SS重要的转录激活因子LcrF调控T3SS基因转录的机制开展了研究，并对LcrF与低钙反应蛋白LcrQ在调控功能上的关系进行了探讨。论文主要包括以下三个方面的内容:　　1.pYV毒力质粒编码基因在不同条件下的转录分析。将YPⅢ pYV所有基因上游非编码序列DNA进行扩增并克隆到不包含启动子序列的lacZ报告基因的载体上，构建启动子-lacZ融合质粒文库。通过β-半乳糖苷酶酶活测定的方法，检测了26℃，37℃和37℃低钙条件下所有基因上游非编码序列的启动子活性。通过分析确定了pYV有68个基因前的非编码序列具有启动子活性;其中大部分非编码序列在37℃时转录活性较26℃时增强，而有9个相关基因前的非编码序列在37℃低钙条件下的转录活性增强最为明显。另外，结果还表明由温度诱导的基因转录可能与染色体基因编码的因子有关;而由钙离子缺乏引起T3SS基因转录除了与温度有关外，还与毒力质粒编码的因子密切相关。　　2.LcrF对假结核耶尔森氏菌T3SS转录调控研究。在构建YPⅢ lcrF缺失突变体后，在该突变体中对pYV中68个启动子的转录活性进行全面系统的分析。在37℃低钙条件时，与野生型菌株中转录活性比较，有9个启动子在lcrF缺失突变体中转录活性均明显下降。用外源质粒回复lcrF缺失突变体时，这些启动子序列的转录活性得到回复，说明LcrF可以正调控T3SS基因的转录。进一步采用EMSA实验证实了LcrF可以直接与靶基因非编码序列DNA结合，这一结果表明LcrF对T3SS基因转录正调控作用是直接的。另外，在pYV毒力质粒丢失的菌株中表达LcrF时，无论是在高钙还是在低钙条件，这些启动子的转录活性均得到回复，证明LcrF的转录正调控功能不受钙离子影响。　　3.LcrF与低钙反应蛋白LcrQ协同调控T3SS的研究。LcrF对靶标的调控不依赖于钙离子，但低钙条件下其靶标才被大量诱导表达。为分析低钙反应蛋白LcrQ是否参与低钙条件下LcrF对T3SS的调控过程，我们进一步比较了68个启动子在野生型和与低钙反应相关的调控因子LcrQ过表达菌株中的活性，结果发现过表达LcrQ有9个启动子转录活性明显降低。而这9个启动子也恰是受LcrF调控的9个启动子。通过改变LcrQ和LcrF的表达水平，我们发现，当LcrQ蛋白的量高于LcrF时，就会表现出对T3SS的负调控效应，反之亦然，这说明胞内LcrQ与LcrF表达水平的平衡对T3SS的调控起着重要作用。我们还发现LcrQ的调控功能在lcrF缺失突变株中是消失的，这进一步说明LcrQ的调控功能依赖于LcrF。由于LcrQ蛋白不含有DNA结合结构域，我们推测37℃高钙条件下胞内LcrQ积累，从而阻遏LcrF转录激活功能并抑制LcrF靶标的表达;低钙条件触发LcrQ的分泌，解除对LcrF正调功能的抑制，从而实现LcrF对其靶标的调控。