乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种碱性糖蛋白,主要存在于乳清蛋白中,作为一种新型的骨生长因子,可通过调节骨的生长和代谢过程发挥其功能,促进骨骼生长,相关基础与应用研究已引起广泛关注。乳铁蛋白在被人体摄入后,必须经过胃肠道消化吸收,乳铁蛋白是只能以完整蛋白的形式发挥促成骨作用,还是经过胃液消化之后产生的分子片段也可发挥作用或者两者同时发挥作用未见报道。本研究利用模拟胃液对乳铁蛋白进行不同时间地消化处理,将其分解成不同分子量的多肽片段,经阳离子交换层析和凝胶过滤层析对乳铁蛋白肽进行分离纯化,采用MTT法跟踪监测纯化过程中的样品促成骨增殖活性,筛选出具有较好促成骨细胞增殖活性的多肽。同时,通过生物信息学方法将LF的氨基酸序列与已知具有促成骨细胞增殖活性的蛋白质序列进行比对,进而阐明LF水解片段的结构与其促成骨细胞增殖活性的关系,以此推测LF在经过胃环境消化后的活性机制,主要研究内容及成果如下:本研究首先利用模拟胃液水解LF,水解时间分别为5 min、10 min、30 min、60 min、90 min、120 min、180 min和240 min。利用SDS-PAGE和Tricine SDS-PAGE电泳分析不同水解时间产生的LF水解片段的分子量。实验结果表明:随着水解时间的延长,LF逐渐被水解成小分子量肽段,小分子量肽段浓度逐渐增加。在水解90 min之后水解产物趋于不变,分子量约为5 k Da。然后利用MTT法进行细胞增殖实验,比较不同时间点LF水解产物对成骨细胞增殖活性的影响。促细胞增殖实验结果表明,H5与其他时间点相比能显著促进成骨细胞增殖。利用阳离子交换层析柱SP Sepharose Fast Flow(1.6×10 cm)对H5进行分离纯化,在p H7.4 0.05 M PBS缓冲液(盐浓度)为洗脱液,洗脱流速为3 m L/min的洗脱条件下,分离得到5个峰,通过MTT法确定峰5具有较好促成骨细胞增殖活性。将峰5进行凝胶层析Superdex Peptide 10/300 GL(1.0 cm×300 mm),在洗脱液为p H7.6 0.02 M PBS缓冲液,洗脱流速为0.5 m L/min的洗脱条件下,分离得到2个峰,通过MTT法确定峰5-1具有较好促成骨细胞增殖活性,利用Tricine SDS-PAGE电泳确定峰5-1中含有两种组分,分子量分别为9.35 k Da和6.95 k Da。本研究推测这两种乳铁蛋白肽在乳铁蛋白发挥促成骨细胞增殖活性的过程中发挥了重要作用。将LF与具有成骨细胞增殖活性的骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMP)进行生物信息对比研究表明:LF的氨基酸序列与BMP蛋白具有28.56%相似性,相似部分主要集中在LF的第522-597位氨基酸,此段序列的相对分子量大约为9 k Da,与我们获得的峰5-1中的一个组分的分子量相近。对此段有较高相似度的保守区域利用生物信息学软件进行理化性质、疏水性、磷酸化位点和二级结构进行预测,结合分离纯化得到的水解片段进行综合分析。本课题通过研究牛乳中LF在模拟胃环境下水解产生的不同分子片段的促成骨细胞增殖活性,结合生物信息学推断其结构与活性的关系,进一步阐述乳铁蛋白结构对其促成骨细胞增殖活性的影响,为乳铁蛋白相关产品开发奠定了一定的理论基础。