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体外受精是指将哺乳动物的精子和卵子置于适宜的培养条件下使之完成受精的一种技术。体外受精技术包含卵母细胞的体外成熟培养、精子体外获能、卵母细胞体外受精和受精卵的体外培养四项技术。猪体外受精过程较多发生多精子受精现象，形成不能正常发育的非整倍体染色体胚胎，严重影响了猪体外受精技术的发展。针对多精子受精问题，国内外众多研究者多数从卵母细胞的成熟程度、透明带异常状况、卵泡细胞作用和输卵管分泌物等母体一方进行研究，虽然取得一定成效，但是并没有解决根本问题。事实上，受精过程是精、卵相互作用的结果，精子的获能过程包括获能前的失能状态、获能的早晚与快慢、获能的充分程度、顶体结构以及所处的环境等等均与多精子受精现象有关。依据生产实际，本文从精子来源和精子是否承受冷冻处理两方面入手，以附睾精子、鲜精、冷冻附睾精子和冷冻鲜精作为材料，进行猪的体外受精试验，通过显微观察获能精子的活率、顶体完整率，体外受精单精子受精率、多精子受精率和卵裂率，统计比较微滴法体外受精体系几种来源精子的受精效果，分析研究父系一方精子方面影响体外受精能力的因素和发生多精子受精的原因，为解决多精子受精问题提供依据。根据对实验数据的分析，得到以下几点结论：1、猪四种不同来源精子活率、顶体完整率比较：以活率和顶体完整率为检测指标，将鲜精的检测结果作为对照组，分别检测附睾精子、冷冻—解冻附睾精子和冷冻—解冻鲜精的相应指标，研究探讨以上鲜精与附睾精子在受到冷冻处理前后的变化情况。试验结果表明：冷冻—解冻附睾精子活率为65.2％(2.6×10~4／4×10~4)，精子顶体完整率为43.2％(1.7×10~4／4×10~4)；未冷冻的附睾精子活率和顶体完整率分别为82.3％(3.3×10~4／4×10~4)和62.3％(2.5×10~4／4×10~4)，冷冻前后附睾精子的活率差异不显著(p＞0.05)；顶体完整率差异显著(p＜0.05)；冷冻前后鲜精子的活率差异显著(p＜0.05)；顶体完整率差异显著(p＜0.05)。冷冻—解冻鲜精子的活率与顶体完整率分别为45.5％(1.8×10~4／4×10~4)、40.8％(1.6×10~4／4×10~4)；冷冻—解冻鲜精子组比冷冻—解冻附睾精子组的活率和顶体完整率低，两组间活率差异显著(p＜0.05)，顶体完整率差异不显著(p＞0.05)。结果说明，与鲜精子相比，附睾精子对“冷应激”不敏感，易冷冻保存，冷冻—解冻后顶体膜破坏程度较低。2、猪四种不同来源精子体外受精效果观察：分别对4种不同来源的精子进行体外获能处理，调整精子浓度为10~6个／ml，与体外成熟卵母细胞在体外用传统微滴法进行受精，受精8～10h(mTBM)后，转移到早期胚胎培养液中(IVC-PyrLac-CM)培养至受精后48h，统计比较卵裂率。试验结果表明：与鲜精43.7％(34／78)相比，附睾精子的体外受精卵裂率为42.3％(33／80)，差异不显著(p＞0.05)；与冷冻—解冻附睾精子卵裂率相比40.5％(34／84)，冷冻—解冻鲜精卵裂率为13.5％(10／78)，差异显著(p＜0.05)，与鲜精相比43.7％(34／78)，冷冻—解冻附睾精子卵裂率为40.5％(34／84)，差异不显著(p＞0.05)，冷冻—解冻附睾精子与鲜精一样具有受精能力，且受精能力没有差异。3、猪四种不同来源精子体外多精子受精现象观察：分别对4种不同来源的精子进行体外获能处理，计数精子浓度为10~6个／ml，与体外成熟卵母细胞在体外用传统微滴法进行受精，受精8～10h后，固定，观察进入卵母细胞的精子，统计多精受精率，受精18小时后，固定，用H33342染色，统计单精受精率。结果表明：冷冻—解冻附睾精子单精受精率7.2％(6／84)比鲜精子单精受精率35.5％(27／78)低，差异显著(p＜0.05)。冷冻—解冻附睾精子多精受精率70.2％(59／84)比鲜精多精受精率46.2％(36／78)高，差异显著(p＜0.05)。与鲜精相比35.5％(27／78)，附睾精子的体外受精单精受精率为28.5％(22／80)，差异不显著(p＞0.05)；两者的多精子受精比率分别为46.2％(36／78)和51.8％(41／80)，差异不显著(p＞0.05)。冷冻—解冻附睾精子单精受精率7.2％(6／84)比冷冻—解冻鲜精单精受精率5.2％(4／78)高，差异不显著(p＞0.05)。冷冻—解冻附睾精子多精受精率70.2％(59／84)比冷冻—解冻鲜精多精受精率65.7％(51／78)高，差异不显著(p＞0.05)。综上所述：在体外受精过程中，4种来源的精子经过获能处理后其活率变化为：冷冻—解冻附睾精子65.2％(2.6×10~4／4×10~4)、未冷冻的附睾精子82.3％(3.3×10~4／4×10~4)、冷冻—解冻鲜精子45.5％(1.8×10~4／4×10~4)、未冷冻的鲜精子85.0％(3.4×10~4／4×10~4)；顶体完整率分别为：冷冻—解冻附睾精子43.2％(1.7×10~4／4×10~4)、未冷冻的附睾精子62.3％(2.5×10~4／4×10~4)、冷冻—解冻鲜精子40.8％(1.6×10~4／4×10~4)、未冷冻的鲜精子66.4％(2.6×10~4／4×10~4)；说明冷冻—解冻附睾精子对“冷应激”不敏感，相比之下冷冻—解冻后的精子顶体膜破坏较严重。4种来源的精子以卵裂率为受精能力检测指标经过正常的体外受精处理后，四种来源精子的卵裂率分别为：鲜精43.7％(34／78)，附睾精子42.3％(33／80)，冷冻—解冻附睾精子40.5％(34／84)，冷冻—解冻鲜精13.5％(10／78)；说明附睾精子具有正常的受精能力，且附睾精子受精能力与鲜精比较，差异不显著(p＞0.05)。冷冻—解冻附睾精子单精受精率为7.2％(6／84)，冷冻—解冻鲜精单精受精率为5.2％(4／78)，所以冷冻—解冻鲜精单精受精率比附睾精子低，差异不显著(p＞0.05)，这是由于冷冻—解冻的附睾精子中获能精子浓度大，因而多精子受精率高；未受冷冻打击的附睾精子和鲜精顶体完整率高，这类精子体外受精后多精子受精率低。