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背景:肌肉萎缩症是一种单基因神经肌肉疾病,该疾病范围从婴儿期的先天性肌肉营养不良到成年期的轻度肢体无力,严重危害了人类健康,而研究骨骼肌修复可为治疗肌肉萎缩症提供新思路。小鼠成肌细胞系(C2C12)是肌肉萎缩研究时最常用的细胞系,其被报道有两个不同分化方向:肌源性分化和成骨分化。肌源性分化受到包括细胞因子、生长因子和营养成分等因素的影响。而成骨分化则需骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMPs)诱导,其通过抑制肌生成和诱导成骨分化来强烈影响成肌细胞的分化程序,其功能障碍可导致相关病理。micro RNA-186-5p被鉴定为肌生成素(myogenin,Myo G)转录后的调控因子,它特异性地结合到其3’-非翻译区导致其下调,即micro RNA-186-5p通过下调肌生成素抑制成肌细胞分化。三氨基酸环延伸(Three amino acid loop extension,TALE)同源结构域的转录因子PBX1被报道通过调控多营养因子和骨糖蛋白转录来促进胎儿生长。虽有研究表明PBX1是协助促肌源性转录因子(Myo D)依赖的Myo G激活所必需的,然而对miRNA-186-PBX1在肌肉方面和C2C12细胞成骨方向的研究并未深入。本研究旨在深入探究miRNA-186-5p-PBX1对骨骼肌不同分化方向的影响及分子机制,为肌肉和骨骼肌再生这一研究方向提供实验基础。方法:在本研究中,我们首先通过RT-q PCR,Western Blot检测,在C2C12细胞往成肌方向分化过程中,PBX1和Myo G的表达量;设计并构建小鼠肌肉损伤模型,取损伤不同天数的小鼠胫骨前肌组织,在肌肉损伤组织中检测PBX1的表达。然后,构建并筛选过表达和敲降PBX1的稳转细胞系,对稳转细胞进行Ed U细胞活性增殖实验和CCK-8细胞毒性测试。紧接着,对稳转细胞系进行Myo G,My HC免疫染色和检测肌肉分化相关基因的表达量。通过给小鼠注射敲降PBX1的病毒后,再分别在不同天数后注射心肌毒素(CTX),建成实验所需模型后,通过RT-q PCR、Western Blot,免疫荧光染色分别检测PBX1对损伤肌肉修复的影响。为了研究miRNAs在调节PBX1中的作用,通过生物信息学预测3个miRNAs(miR-185-5p、miR-186-5p、miR-142-5p)。首先在C2C12分化不同天数后检测三个miRNA的表达量,然后通过双荧光素酶报告实验检测,验证miR-186-5p和PBX1的3′-UTR是否特异性结合。通过RT-q PCR、Western Blot检测瞬时转染miR-186-5p质粒后PBX1的表达,对My HC进行免疫荧光染色,验证miR-186-5p是否靶向PBX1。最后通过回复实验,检测miR-186-5p是怎样调控PBX1和对C2C12细胞分化的影响。为了进一步探究其作用机制,染色质免疫沉淀检测P300、H3K9等组蛋白乙酰转移酶与PBX1和Myo G启动子是否有联系。通过茜素红染色实验,验证PBX1是否抑制或减弱BMP2对C2C12细胞向成骨方法分化的诱导作用。结果:在C2C12细胞成肌分化过程中,PBX1和Myo G的表达量显著升高,此外,在CTX损伤的小鼠模型中,PBX1的表达随着肌肉修复的进行显著上调,预示PBX1可能参与C2C12细胞成肌分化过程并发挥关键作用。成功构建并筛选过表达或敲降PBX1的稳转成肌细胞系。过表达PBX1显著抑制C2C12细胞增殖,反之,敲降促进其增殖。过表达PBX1能够上调肌肉分化相关基因Myo D、Myo G、My HC的RNA水平和蛋白表达水平,另外,免疫荧光实验显示过表达PBX1组的成肌细胞形成肌管的能力较对照组高。生物信息学分析显示,miR-142-5p、miR-186-5p和miR-185-5p可能靶向PBX1调控其表达,首先,我们在C2C12细胞分化过程中检测三个miRNA的表达量,结果发现miR-186-5p和miR-185-5p在C2C12细胞分化过程中显著升高,提示其可能在骨骼肌肌生成中发挥作用。进一步的荧光素酶报告实验证实,miR-186-5p能够通过靶向PBX1的3′-UTR区域对其进行转录后调控。在C2C12细胞中,过表达miR-186-5p显著下调PBX1的表达水平,同时,抑制肌肉细胞分化相关基因的表达,回复实验进一步确定miR-186-5p是通过负向调控PBX1来抑制C2C12分化。染色质免疫沉淀实验初步证明P300、H3K9等组蛋白乙酰转移酶通过PBX1来调控Myo G启动子的组蛋白乙酰化水平,从而促进C2C12细胞向成肌方向分化并融合成肌管。茜素红染色实验证明PBX1能有效减弱BMP2对C2C12细胞向成骨方向分化的促进作用。结论:miR-186-5p通过调控PBX1,进而调控Myo G的组蛋白乙酰化水平,从而影响骨骼肌损伤修复。