随着DNA合成和测序的快速发展,菌株改造开始成为代谢工程和合成生物学中的限速步骤。我们开发了一种称为gRNA-tRNA-array Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9(GTR-CRISPR)的系统,用tRNA序列将多个gRNA串联起来表达,极大提高了在酿酒酵母中的基因编辑数目和效率。利用此系统,在获得引物后7天内,能够构建出质粒并同时编辑8个基因,效率为87%,为目前世界上在酿酒酵母中编辑效率最高和数目最多的基因编辑体系。我们进一步开发了一种更快捷的GTR-CRISPR系统,通过将Golden Gate反应液直接转化入酵母,跳过了大肠杆菌中的构建质粒步骤,极大地节约了时间。利用快速方法,我们能够在获得引物后3天内同时编辑6个基因,效率为60%,即使是未优化的gRNAs效率也能达到23%。我们利用该系统来简化酵母脂质代谢网络,仅在10天内就完成了对8个基因的删除,提高了游离脂肪酸产量约30倍。