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梨(Pyrus communis L.)是世界上最重要的作物之一。梨白粉病和火疫病等真菌病害是世界梨产区广泛发生的病害,感染真菌性病害严重的会造成树体死亡,因此通过选育抗病品种的途径来解决梨因真菌感染而造成的问题具有重要的经济意义。本研究的目标就是建立梨离体叶片高效再生体系,并利用天然的植物转基因系统——根癌农杆菌介导,以梨品种“丰产”(Fertility)为试材,在绿色组织特异表达的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶的激活酶(Rubisco-activase)启动子(RCAP)驱动下,将抗真菌?-硫堇蛋白(?-thionin)Rs-afp1 基因和 uidA(gus)基因导入离体叶片,获得 nptⅡ抗性植株,培养新的抗病品种。 试验研究了基本培养基、激素配比、细胞分裂素、生长素、培养基添加物、蔗糖浓度、pH 值及叶龄与接种方式对梨离体叶片不定芽再生的影响,优化了再生条件,建立起了高效、稳定的离体叶片再生体系。结果表明,NN69 的基本培养基在诱导梨离体叶片再生方面明显优于 MS、LE 和C;合适的激素配比及浓度是提高离体组织再生不定芽频率的关键;NAA比 IBA 有更强的诱导梨离体叶片再生的活性;外植体的基因型显著影响不定芽再生,金花和丰产的再生频率较高,可达 90%以上;分化培养基中添加 AgNO3和 CH,能够促进不定芽的再生;黑暗诱导处理也影响再生,接种后暗处理 20d,再生频率最高。在 NN69+BA5mg/L+NAA0.3mg/L+AgNO34.5mg/L+CH300ppm+蔗糖 3%的培养基上,金花和丰产的再生频率最高,分别为 100%和 95.3%。不定芽伸长时改用增殖培养基 MS 附加BA1mg/L、IBA0.2mg/L。芽长至约 0.5cm 时转到含 IBA0.3mg/L 的生根培养基上,20 天后即可长出白色细长的根,然后将再生苗移栽到砂石中炼苗,成活率可达 85%。 在建立高效的梨离体叶片不定芽再生体系基础上,研究了梨转化过程中影响转化的诸因素,初步建立了梨的遗传转化系统。优化过程如下:取新展开的试管苗幼嫩叶片接种于诱导培养基上预培养 1d,用携带目的基 2<WP=8>山东农业大学硕士学位论文因的农杆菌 EHA105 浸染 30min,然后放置到添加 20μM AS 的诱导培养基上共培养 3d,除菌后,移入预筛选培养基(NN69+BA5mg/L+NAA0.3mg/L+AgNO34.5mg/L+CH300ppm+Carb 250mg/L+Cef250mg/L)预筛选3d,再移入筛选培养基(预筛选培养基附加 Kan25mg/L)进行筛选,最后得到15 个抗性芽。转化体经 PCR 和 Southern blot 杂交检测,证实了 ?-硫堇蛋白 Rs-afp1 基因和 gus 基因已经整合到梨的染色体组上。gus 染色证实了RCAP 启动子在梨组织中的特异性表达。目前,转基因植株已移栽于大田,正在进行农业性状鉴定。