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我国大豆产量远不能满足人民生活水平的需求,要依靠大规模进口国外转基因大豆,这严重威胁着国家粮食安全。同时由于种质资源的限制,传统育种很难在短期内大幅度提高大豆产量。基因工程技术的诞生和发展为作物遗传改良开辟了新途径。
本研究从大豆T-DNA插入突变体中筛选到一株表型变异明显的材料,与对照相比突变体植株茎秆粗壮、分枝多、叶片大而厚、生物量大、单株荚数显著增加,单株产量增加20.9%。对其开展深入研究,找出造成这些变异的分子调控机制,对通过遗传技术育种提高大豆产量具有重要意义。为此,本研究首先鉴定了T-DNA插入位点,分析了外源插入引起的内源基因的表达变化。具体研究结果如下:
1.运用TAIL-PCR技术鉴定出突变体大豆中T-DNA的插入位点,通过对位点邻近基因定量PCR分析,发现外源T-DNA的插入影响了GmPTIP基因表达,推测GmPTIP是引起表型变化的目的基因。
2.克隆大豆全长GmPTIP基因,并运用农杆菌介导大豆子叶节转化法,成功在野生型大豆Williams82中过表达。同时构建针对GmPTIP及其同源基因的Crispr/Cas9敲除载体,对其进行敲除。经过筛选鉴定,获得11株过表达T0代阳性株系,其中7个株系遗传到T1代;72株T0代不同类型敲除转基因植株,抽取34株进行测序鉴定,得到不同类型编辑株系18株,10个编辑株系稳定遗传到下一代。
3.成功构建了亚细胞定位载体,并瞬时转化到烟草细胞。观察分析GmPTIP与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况,初步将GmPTIP基因编码的相关蛋白定位于细胞膜上。
4.GmPTIP基因表达与植株表型对应分析表明,过表达株系GmPTIP基因表达显著上调,在其T1代株系中表现出生长发育旺盛,同化量高等表型;部分T1代敲除株系GmPTIP基因表达下调,植株则表现出矮小,生长发育迟缓等表型。因此推测GmPTIP基因在大豆生长发育过程中发挥重要调控作用。
本研究从大豆T-DNA插入突变体中筛选到一株表型变异明显的材料,与对照相比突变体植株茎秆粗壮、分枝多、叶片大而厚、生物量大、单株荚数显著增加,单株产量增加20.9%。对其开展深入研究,找出造成这些变异的分子调控机制,对通过遗传技术育种提高大豆产量具有重要意义。为此,本研究首先鉴定了T-DNA插入位点,分析了外源插入引起的内源基因的表达变化。具体研究结果如下:
1.运用TAIL-PCR技术鉴定出突变体大豆中T-DNA的插入位点,通过对位点邻近基因定量PCR分析,发现外源T-DNA的插入影响了GmPTIP基因表达,推测GmPTIP是引起表型变化的目的基因。
2.克隆大豆全长GmPTIP基因,并运用农杆菌介导大豆子叶节转化法,成功在野生型大豆Williams82中过表达。同时构建针对GmPTIP及其同源基因的Crispr/Cas9敲除载体,对其进行敲除。经过筛选鉴定,获得11株过表达T0代阳性株系,其中7个株系遗传到T1代;72株T0代不同类型敲除转基因植株,抽取34株进行测序鉴定,得到不同类型编辑株系18株,10个编辑株系稳定遗传到下一代。
3.成功构建了亚细胞定位载体,并瞬时转化到烟草细胞。观察分析GmPTIP与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况,初步将GmPTIP基因编码的相关蛋白定位于细胞膜上。
4.GmPTIP基因表达与植株表型对应分析表明,过表达株系GmPTIP基因表达显著上调,在其T1代株系中表现出生长发育旺盛,同化量高等表型;部分T1代敲除株系GmPTIP基因表达下调,植株则表现出矮小,生长发育迟缓等表型。因此推测GmPTIP基因在大豆生长发育过程中发挥重要调控作用。