膝骨关节炎（Knee osteoarthritis,KOA）是老年人残疾和活动障碍的重要病因之一,其临床表现为关节痛、关节积液、关节僵硬和关节畸形。膝骨关节炎的发病机制尚不清楚,寻找一种能够有效减轻膝关节内侧负荷、减轻疼痛甚至逆转骨关节炎的治疗方式迫在眉睫。我们的前期研究显示,近端腓骨截骨术（PFO）治疗后,膝关节骨关节炎患者的影像学表现有明显改善,膝关节功能也有了明显的恢复,证实PFO是一种简单、经济、有效的治疗骨关节炎的手术方式,但目前对于PFO的生物学机制的相关研究较少,并且研究主要基于尸体标本和影像学资料,难以揭示其背后的病理学机制和分子生物学机制。因此,建立一个PFO小鼠模型从影像学和病理学的角度观察PFO能否减轻骨关节炎是具有重要意义的。众所周知,骨关节炎的发生与发展的主要原因是软骨的进行性破坏。软骨细胞的凋亡坏死、软骨细胞肥大的加速和关节软骨局灶性钙化的增加最终均能导致软骨的破坏,这些生物学过程与骨关节炎的发病、发病机制密切相关。越来越多的研究发现,Lnc RNAs在骨关节炎组织中存在特异性表达,并在骨关节炎发生和发展过程中发挥着重要的作用,能够在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多个层面调控基因的表达,参与多种生物学过程,包括:细胞增殖、凋亡、发育和免疫反应。因此,筛选骨关节炎特异性Lnc RNAs生物标记物,研究Lnc RNAs在软骨细胞炎症应答过程中发挥的调节作用具有重要意义。在本研究中,我们通过建立小鼠近端腓骨切除术模型,观察近端腓骨截骨术对于延缓关节退变,抑制膝关节骨关节炎的作用。为了进一步了解骨关节炎发生发展的分子机制,我们对IL-1β诱导的炎症软骨细胞进行高通量测序,筛选差异性表达的Lnc RNA,选取UHCI作为研究对象,探讨其在软骨细胞炎症应答过程中的调控机制。第一部分应用近端腓骨截骨术治疗小鼠内侧膝骨关节炎模型的建立与机制探讨目的:本研究通过建立小鼠近端腓骨切除（proximal fibular osteotomy,PFO）模型,观察PFO延缓关节退变,抑制膝关节内侧骨关节炎的进展。方法:1.应用内侧半月板失稳术（destabilization of the medial meniscus,DMM）诱导创伤后骨关节炎（osteoarthritis,OA）动物模型;2.建立PFO动物模型以观察PFO对于膝关节内侧骨关节炎的保护作用;3.应用micro-CT观察膝关节软骨下骨的硬化程度;4.应用番红O-固绿染色评估膝关节软骨的的破坏程度;5.通过测量膝关节间隙角（condylar–plateau angle,CPA）及股骨胫骨解剖角（anatomical femorotibial angle,a FTA）观察膝关节力线的改变情况。结果:1.PFO能够减少膝关节骨赘形成和软骨下骨硬化的进展研究发现,PFO处理后能够明显DMM小鼠内侧胫骨平台的骨赘形成。另外,结果显示DMM小鼠出现了明显的内侧胫骨平台骨硬化,而这一现象在PFO处理后显著减轻。为了量化不同组别之间的骨硬化程度,我们计算了不同组别、不同时间点的骨体积分数（trabecular bone volume per total volume,BV/TV）,结果显示,术后2周DMM组的BV/TV值（59.10±1.80）%显著高于对照组（48.57±1.13）%（P<0.01）,而DMM+PFO组（52.60±1.11）%相对DMM组有所降低（P<0.05）。同样,在术后4周,对照组,DMM组和DMM+PFO组分别为（47.34±1.32）%、（61.19±1.67）%和（53.40±1.21）%,其差异具有统计学意义（P<0.05）。2.PFO能够抑制骨关节炎软骨损坏的发展应用番红O-固绿染色观察小鼠膝关节软骨的变化情况发现,DMM组出现了严重的软骨破坏表现,而DMM+PFO组的软骨破坏情况明显较轻。分别对各组、各时间点的软骨破坏情况应用ORASI评分,结果显示,术后2周对照组,DMM组和DMM+PFO组的最大关节炎评分分别为0.40±0.19,2.20±0.37和1.00±0.27,差异具有统计学意义（P<0.05）。术后4周,对照组,DMM组和DMM+PFO组的最大关节炎评分分别为0.60±0.19,3.00±0.32,和1.80±0.37,差异具有统计学意义（P<0.05）。另外,术后2周对照组,DMM组和DMM+PFO组的总关节炎评分分别为0.90±0.19,7.80±0.37,6.00±0.32,差异具有统计学意义（P<0.05）。术后4周对照组,DMM组和DMM+PFO组的总关节炎评分分别为1.00±0.22,10.80±0.37,8.00±0.45,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.PFO能够通过延缓下肢力线的改变抑制骨关节炎的进展通过对micro-CT扫描后导出的术后4周小鼠膝关节前后位片进行测量,发现对照组,DMM组和DMM+PFO组的膝关节间隙角（CPA）分别为-2.32°±0.37°、-0.78°±0.47°和-2.14°±0.34°,差异具有统计学意义（p<0.05）。DMM组的股骨胫骨解剖角（a FTA）为8.38°±0.45°,高于对照组6.85°±0.46°（P<0.05）,而DMM+PFO组（7.54°±0.44°）相对于DMM组虽然有增加的趋势,但其差异无统计学意义（P=0.22）。结论:1.PFO能够抑制胫骨平台软骨下骨重塑;2.PFO能够抑制骨关节炎软骨破坏的发展;3.PFO减轻骨关节炎的进展的机制可能是通过延缓下肢力线改变而实现的。第二部分IL-1β诱导的软骨细胞损伤模型中长链非编码RNA表达谱筛选及表达验证目的:应用高通量测序筛选IL-1β诱导的软骨细胞损伤模型中Lnc RNAs表达谱,寻找差异表达Lnc RNAs。方法:1.应用IL-1β刺激人软骨细胞CHON-001,制作人软骨细胞损伤模型,对照组给予等量PBS溶液,收集细胞,提取Total RNA;2.将提取的Total RNA质控、处理后获取文库用于高通量测序;3.将测序结果质控后用于Lnc RNAs筛选;4.对筛选出的Lnc RNAs进行差异表达分析与验证。结果:1.Total RNA质控显示符合Lnc RNAs测序要求对照组（Con组）和实验组（IL组）两组共六个样本分别给予IL-1β（10ng/m L）和等量PBS溶液培养12小时后收集细胞,Trizol法提取总RNA后,经琼脂糖凝胶电泳、Nano Drop ND-2000分光光度计、Agilent 2100显示RNA纯度好,无明显降解,其纯度和完整性符合Lnc RNAs测序要求。2.候选Lnc RNAs的筛选测序完成并获取转录本后,对总计231844个转录本进行Lnc RNAs筛选,共有已知Lnc RNAs 2649个,新发现Lnc RNAs 4280个,TUCP 4158个,新发现Lnc RNAs中linc RNA占比12.3%,anti-sense Lnc RNA占2.5%,intronic Lnc RNA占85.1%。3.差异表达分析与验证按照Q value<0.05,2组共6个样本候选转录本进行筛选,共筛选出差异Lnc RNAs 21个,其中12个Lnc RNAs在IL-1β诱导的炎性软骨细胞中表达上调,9个Lnc RNAs表达下调。选择8个差异表达Lnc RNAs,其转录本ID分别为:LNC＿000346、LNC＿000888、LNC＿001916、LNC＿003694、LNC＿003814、ENST00000434309.1、ENST00000412788.5,ENST00000417089.6,对所选择的8个Lnc RNAs的表达水平进行qRT-PCR验证,发现在IL-1β诱导的炎症软骨细胞中,上述8个Lnc RNAs表达趋势与测序结果一致,证明测序结果可靠。结论:1.2组共6个样本提取Total RNA后,质控显示符合Lnc RNAs测序要求;2.通过高通量测序及分析筛选出IL-1β诱导的软骨细胞差异性表达Lnc RNAs 21个,其中12个上调,9个下调;3.通过qRT-PCR方法证实筛选结果可靠,可用于后续研究。第三部分Lnc RNA UHCI/Birc2/NFκB信号轴在人软骨细胞CHON-001炎症应答过程中的调控作用目的:研究UHCI在调控CHON-001细胞炎症应答过程中的调节作用,并初步探讨其在调控炎症信号通路调控中作用机制。方法:1.分别应用过表达质粒和Si RNA转染UHCI,qRT-PCR观察过表达和敲低效率,Western Blot观察炎症因子IL-1β和IL-6的蛋白表达变化;2.应用荧光原位杂交与免疫荧光双染色观察UHCI在CHON-001细胞中的亚细胞定位;3.对差异表达m RNA进行GO分析,寻找m RNA在不同生物学过程、分子功能和细胞组分中的富集情况;4.对差异表达m RNA进行KEGG pathway分析,寻找m RNA在不同信号通路中的富集情况;5.观察过表达和敲低UHCI后,Birc2的蛋白表达变化;6.观察过表达和敲低UHCI后,NFκB的激活情况;7.观察UHCI是否能够调控CHON-001软骨细胞炎症模型中Birc2/NFκB信号通路的相关指标变化。结果:1.UHCI能够调控软骨细胞炎症因子IL-1β、IL-6的表达过表达UHCI后,Western Blot显示IL-1β、IL-6蛋白表达量较对照组明显增加;而敲低UHCI后,IL-1β、IL-6蛋白表达量较对照组明显减少。2.荧光原位杂交与collagen II免疫荧光双染观察UHCI的细胞定位collagen II主要表达在胞质中,而UHCI在细胞核中的丰度较高,在细胞质中也有分布,但丰度较低。提示UHCI可能在细胞核和细胞质中发挥调控作用,并以细胞核内调控为主。3.Lnc RNA共定位差异表达m RNA的功能富集分析GO term分析显示富集程度较高的模块分别有:（1）生物学过程:核糖核酸酶活性的调节、细胞因子介导的信号通路、细胞坏死等;（2）分子功能:2’-5’-寡腺苷酸合成酶活性、腺苷转移酶活性、双链RNA结合等;（3）细胞组分:细胞器核糖体亚单位、线粒体核糖体亚单位等。KEGG pathway富集分析显示,TNF信号通路、NFκB信号通路、细胞凋亡信号通路、Fox O信号通路等富集程度较高。4.Birc2可能是UHCI的靶基因过表达UHCI后,qRT-PCR显示Birc2的RNA表达升高,Western Blot显示蛋白表达量也相应升高;而敲低UHCI后,Birc2 RNA和蛋白的表达量均出现下降。5.UHCI能够调控NFκB信号通路p65、p50的表达过表达UHCI后,NFκB信号通路p65、p50蛋白表达明显上调,而敲低UHCI后,p65、p50蛋白表达明显下调。6.UHCI能够通过作用于Birc2/NFκB信号通路调控软骨细胞炎症应答应用IL-1β处理CHON-001细胞后,Western Blot结果显示Birc2蛋白表达上调,同时NFκB p65、NFκB p50表达量均发生上调,炎症因子IL-1β表达增加,而敲低UHCI后,能够抑制上述蛋白的表达变化,过表达UHCI能够导致上述蛋白的表达量进一步增加。结论:UHCI能够调控炎症因子IL-1β、IL-6的表达,定位于细胞核,可能通过转录或转录前水平发挥调节作用;Birc2可能是UHCI的靶基因,UHCI可能通过调控Birc2促进NFκB信号通路的激活;UHCI在软骨细胞炎症应答过程中发挥重要作用,敲低UHCI能够抑制软骨细胞的炎症应答。