[研究背景及目的]病毒性肝炎是由多种不同嗜肝病毒包括甲、乙、丙、丁以及戊型肝炎病毒或其他病毒如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒等,引起的一组以肝脏损害为主要临床特征的急或慢性传染病,其中乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染在中国仍然较为普遍,人群携带率高达7.18%。由其发展的重型病毒性肝炎(fulminant viral hepatitis, FVH)或者肝功能衰竭病情极为凶险,是一类在短期内出现肝细胞的大量坏死、严重肝功能不良甚至合并严重并发症如肝性脑病、自发性细菌性腹膜炎、肝肾综合征等为临床特征的严重肝脏疾病。由于临床上缺乏有效特异的治疗措施和干预手段,若不及时进行肝移植,其临床转归和预后非常差。有研究证实3型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain 3, MHV-3)诱导的小鼠暴发型肝炎,其病程转归及疾病预后和人类FVH相似,因此目前是研究FVH良好的动物模型之一。FVH的发病机制非常复杂,肝炎病毒感染并在肝细胞内大量复制,通常不直接引起肝细胞变性坏死,肝细胞损伤主要是由于宿主针对病毒产生的一系列免疫应答尤其是细胞免疫造成的,其中针对肝炎病毒蛋白抗原特异性的CD8+T淋巴细胞(CTL)对于肝炎病毒的清除和疾病的转归具有关键作用,然而其他免疫细胞尤其是调节性T细胞在FVH中的作用尚未完全明确。研究证实肝脏内淋巴细胞是肝内非实质细胞的重要组成部分,由病毒诱导的人类小鼠和肝脏疾病中会发生肝脏内炎症细胞的大量聚集。肝脏在慢性病毒性肝炎过程中维系着一种免疫耐受的状态,其中调节性T细胞是机体维持自身免疫耐受的重要细胞组分,在保持生理状态机体免疫平衡、移植免疫耐受、自身免疫性疾病等病理生理过程中发挥关键作用。目前在肝脏疾病研究较多的调节性T细胞中是CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg),主要可以通过分泌的抑制性细胞因子如白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)以及转移生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)来发挥其抑制性的免疫调节的作用。除此以外,越来越多的具有免疫调节功能的细胞被证实,如自然杀伤性T细胞(natural killer T cell, NK T)、CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞(double negative T cell, DN T细胞)、γ8T细胞等。然而调节性T细胞在不同的疾病模型中其表型和功能存在明显差异,比如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)中DN T细胞能够促进机体产生自身抗体；在立什曼原虫感染中,TCRαβ+DN T细胞可发挥促进了炎症发展的作用；Treg在MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎模型中,通过表达纤维蛋白原样蛋白／纤维介素2(fibrinogen like protein 2/fibroleukin, fgl2)促进暴发型肝炎的发生等。γδT细胞是一种表型和功能独特的T淋巴细胞,主要由CD4-CD8-γδT细胞亚群组成,仅少数为CD4-CD8+γδT细胞亚群。目前对于DN T细胞以及γδT细胞在FVH发生发展中发挥的作用的相关报道较少。fg12包括跨膜型以及分泌型并发挥不同的功能。其中跨模型fg12是一种新型的凝血酶原酶分子,主要由活化的巨噬细胞或内皮细胞表达,通过促进凝血酶原的裂解以及纤维蛋白的沉积,最终导致微循环障碍和肝脏炎症反应的发生,在FVH中肝细胞缺氧性损伤和大量炎性坏死的发生机制中发挥重要作用。本研究室前期研究结果显示,通过干扰小鼠体内龟12的表达,可导致暴发性肝炎小鼠的生存率显著升高。有研究证实Treg可以通过产生分泌型fg12促进暴发型肝炎的发生,然而其他免疫细胞如DN T细胞与fg12的关系尚无研究。本研究室前期结果提示MHV-3在感染BALB/cJ小鼠后,有一群表型功能均与以往报道不同的DN T细胞,在疾病进程中出现数量的显著增加及大量活化,同时表达fg12分子,转移过继这群细胞会促进小鼠暴发型肝炎的发生,然而其深入的机制需要进一步研究。为探索DN T细胞及γδT细胞在小鼠暴发型肝炎模型中的作用及机制,本课题具体研究目标如下：1.研究脾脏DN T细胞mfgl2的表达及促凝血功能2.研究脾脏DN T细胞通过表达mfgl2促进暴发型肝炎发生的机制3.初步探索肝脏DN T细胞促进NK细胞活化的机制4.研究肝脏γδT细胞在小鼠暴发性肝炎中的作用及机制[研究方法]1.采用MHV-3经腹腔注射途径感染BALB/cJ小鼠建立暴发性小鼠肝炎模型,在不同感染时间点Oh、24h、48h以及72h时对小鼠肝组织行伊红-苏木精染色(HE染色),观察肝脏病理学改变,并检测血清ALT和AST水平。2.磁珠分选正常以及MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的脾脏DN T细胞,通过免疫共聚焦法检测其mfgl2的表达,并通过促凝活性检测实验(procoagulant assay, PCA)体外检测脾脏DN T细胞的功能。3.使用特异性针对mfgl2的microRNA腺病毒体内干扰BALB/cJ小鼠的mfgl2表达,并通过尾静脉过继MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的脾脏DN T细胞,观察小鼠生存率,检测肝脏病理学改变及血清ALT和AST水平变化,同时通过real-time PCR以及western blot来检测肝脏mfgl2的分子及蛋白水平的表达情况。4.尾静脉过继MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠的DN T细胞,观察小鼠肝脏内NK细胞的CD69表达情况,体外将感染48h时分离的肝脏DN T细胞以及感染24h分离的肝脏NK细胞,体外共培养12h后,体外检测CD69表达、胞内干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌,以及利用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放实验检测NK细胞对原代肝细胞的杀伤作用的变化。5.流式细胞术检测γδT细胞在肝脏、脾脏和外周血等器官的比例数量以及活化水平变化,同时检测肝脏γδT细胞的表面分子包括CD25、CD28、CD30、CD44的表达,通过胞内细胞因子染色检测MHV-3感染前后肝脏γδT细胞分泌IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、FasL、IFN-γ、TNF-α、穿孔素(perforin)、颗粒酶(granzyme B)等细胞因子谱的水平,检测γδT细胞表面α-Galcer二聚体来鉴定γδT细胞是否为传统的NKT细胞。6.磁珠分选肝脏γδT细胞,原位灌流胶原酶消化法分离小鼠原代肝细胞,利用LDH释放实验检测肝脏γδT细胞在体外对原代肝细胞的杀伤作用,体外使用单克隆抗体阻断IFN-γ、TNF-α来验证肝脏γδT细胞损伤肝细胞的主要分子途径。[实验结果]1.MHV-3感染BALB/cJ小鼠后,随着感染时间的延长,肝脏组织病理学首先出现肝细胞嗜酸性变以及气球样变,形成点状和局灶状坏死,伴随大量淋巴细胞浸润,最后出现大面积肝细胞破坏,网织纤维塌陷等改变。同时BALB/cJ小鼠血清转氨酶ALT, AST水平显著升高,在感染后72h时分别达到最高值(9418.7±23.6 IU/L,8195.3±224.0 IU/L)。2.通过免疫共聚焦法检测发现MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠脾脏DN T细胞高表达mfgl2,与前期real-time PCR和western blot的检测结果相一致。mfgl2集中在DN T细胞膜上表达,初步证实为跨模型mfgl2。另外体外促凝活性实验检测结果显示这群表达mfgl2的DN T细胞在体外具有PCA活性(0h为30.30±52.48mU/ml,48h为651.51±301.80 mU/ml),进一步验证该mfgl2分子为传统跨模型mfgl2.3. BALB/cJ小鼠体内使用特异性针对mfgl2的microRNA腺病毒可有效干扰肝内mfgl2分子及蛋白水平的表达,使生存率提高至33.3%,同时显著改善肝脏组织病理学改变,降低血清ALT、AST水平,在这种情况下,尾静脉高压注射MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠脾脏DN T细胞会逆转mfgl2 microRNA的干扰作用,导致肝内mfgl2表达水平升高,发生明显肝组织病理学改变,血清ALT、AST水平显著升高,小鼠全部死亡。4.尾静脉过继MHV-3感染48h的BALB/cJ小鼠体内分离的DN T细胞后24h,小鼠肝脏内NK细胞表达CD69的水平显著升高,出现明显活化。将肝脏DN T细胞以及NK细胞体外共培养12h, DNT细胞可促进NK细胞表达CD69比例增加,同时分泌炎性细胞因子TNF-α水平升高,NK细胞对原代肝细胞的杀伤作用明显增强。5.流式细胞术检测发现,MHV-3感染BALB/cJ小鼠48h时,无论在外周血、肝脏及脾脏内γδT细胞的比例较正常时显著升高,绝对计数结果显示随着感染时间的延长,外周血、肝脏及脾脏内γδT细胞的总数显著下降。肝脏内γδT细胞表面高表达CD44分子,但无明显CD25、CD28及CD30分子的表达,经鉴别该群γδT细胞并非传统的NK T细胞,同时随着感染时间的延长,γδT细胞表达活化分子CD69的比例显著升高。对肝脏γδT细胞胞内细胞因子谱检测发现,感染后的γδT细胞分泌IFN-γ及TNF-α水平明显增加,其他细胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、FasL、perforin、granzyme B无明显表达。6.通过LDH释放杀伤实验检测发现,MHV-3感染BALB/cJ小鼠48h肝脏内分离的γδT细胞对感染的原代肝细胞随着效靶细胞比例的升高其体外杀伤作用明显增强,单用或合用IFN-γ及TNF-α的单克隆阻断性抗体,可显著降低γδT细胞对原代肝细胞的杀伤作用,以TNF-α阻断后的效果更明显。[结论]1.本研究基于前期实验结果更深入探讨了DN T细胞通过高表达膜型mfgl2分子,促进免疫凝血的作用,导致大量肝细胞的炎性坏死,最终诱导了暴发型病毒性肝炎的发生。2.DN T细胞体内及体外均可促进NK细胞的活化,并诱导NK细胞产生大量炎性细胞因子,增强NK细胞对肝细胞的杀伤作用,可能为DN T细胞促进暴发型小鼠肝炎的发生的另一条途径。以上两个方面的研究结果为进一步阐明病毒诱导的暴发型肝炎的发病机制提供了理论依据,亦为临床上暴发型病毒性肝炎的免疫学治疗提供了重要的靶点。3.γδT细胞在MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎模型中,其比例在感染后显著增加并发生活化,同时高表达炎性细胞因子IFN-γ及TNF-α,并通过依赖IFN-γ及TNF-α的分子途径来发挥杀伤肝细胞的作用,在暴发型病毒性肝炎的发病机制中发挥重要作用。