肾细胞癌又称肾癌,是成人最常见的肾脏肿瘤,可见于各个年龄段,高发年龄50-70岁。在我国,肾肿瘤在泌尿外科肿瘤中占第二位,仅次于膀胱肿瘤。且肾癌对放疗、化疗效果不明显副作用大。由于其起病隐匿,诊断时有一部分已发生转移。即使是局限性肾癌,采用根治性切除术后仍有近30%患者会复发。因此,全身转移性肾癌及肾癌术后复发的治疗成为泌尿外科研究的重点和难点。随着研究深入,发现肾癌多存在VHL-HIF-VEGF信号通路。因此,抑制或阻断VHL-HIF-VEGF信号通路,特别是阻断VEGF或其受体VEGFR,就可能抑制肾癌的生长。贝伐单抗(Bevacizumab)是VEGF特异性抗体,是经过人源化改造的鼠源抗体,与VEGF特异性结合并阻断其生物活性。2007年12月美国FDA批准转移性肾癌的一线治疗方案其中就有贝伐单抗联合IFN-α的靶向治疗。然而,通过杂交瘤技术获得的鼠源单抗经过人源化改造,不可能完全去除抗体的免疫原性,且抗体空间构型可能发生改变,亲和力往往会降低,在临床上表现为小剂量疗效有限,大剂量或联合用药导致副反应增加的问题。目前常用噬菌体展示技术、核糖体展示技术、酵母菌展示技术在内的常用的人源抗体展示技术,都没有或者有着与哺乳动物细胞不同的蛋白质折叠和转录后修饰功能,所以其所展示的抗体不能形成正确的三级结构,亲和力不高,表达及纯化难度大,且只能筛选到抗体片段(单链抗体可变区片段scFv或者抗原结合片段Fab)而非全长抗体。为了克服以上抗体制作的不足,研究者尝试利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术筛选人源抗体。迄今为止,哺乳动物细胞表面展示技术所构建抗体库的库容量多局限于104-106,筛选抗体多样性不足,难以满足筛选高亲和力抗体的要求。为了克服上述抗体筛选技术存在的不足,本课题组对现有的哺乳动物细胞展示技术作了技术改良。为了提高筛选到特异性抗VEGF抗体的几率,本实验应用来自于肾癌及自身免疫病患者的外周血淋巴细胞(PBMC)为材料构建抗体库。通过提取患者PBMC的总RNA,进行RT-PCR扩增全套抗体基因,随后使用哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,构建了两个全长人源抗体基因库,库容量达到1010以上。为了提高筛选到特异性抗VEGF抗体的成功率,充分利用贝伐单抗的抗VEGF导向选择作用,本课题通过全基因方法合成了贝伐单抗的轻、重链可变区基因,分别与上述构建好的两个全长人源的抗体库配对,通过四片段连接的方法插入双表达载体pDGB4,构建两个二级抗体库。并构建了用于表达贝伐单抗的阳性对照载体pDGB4-avastin。然后将其稳定转染FCHO细胞,成功构建能稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库。利用流式细胞分选技术,我们能从构建的细胞库中筛选到在细胞表面稳定展示能与VEGF抗原结合的抗体的FCHO细胞。通过两轮的富集,可结合VEGF抗原的阳性细胞分别增加20.7倍和7.8倍；随后利用流式细胞分选术进行了单细胞分选,获得了轻链18株、重链8株可结合VEGF抗原的单克隆细胞。为进一步获得全长人源抗VEGF抗体奠定了基础。一、全长人源初级抗体库的构建及展示目的：采用哺乳动物表面展示技术构建全长人源初级抗体库。方法：1.外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取采集患者静脉血,置入抗凝管中,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,加入Buffer RLT,裂解细胞,一80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。2.cDNA第一链的合成以总RNA为模板,根据V-BASE网站信息所设计合成的全套人抗体重链可变区引物和全套人抗体轻链恒定区引物,逆转录合成cDNA第一条链。3.全套IgG1重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增以合成的cDNA为模板,用对应的特异性引物扩增全套IgG1轻链κ型全长基因及全套IgGl重链可变区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为：94℃预变性5分钟,然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min),随后在延长温度下反应7min,以确保全长目的片段的合成。4.PCR扩增产物的分离纯化用PCR扩增抗体重链可变区基因和全套Kappa轻链。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。5.重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定用BsmBI对PCR扩增的重链基因产物及载体pDGB-HC-TM进行酶切,电泳分析并回收目的片段,将回收的载体片段和抗体基因片段用T4DNA连接酶按1：1进行连接,16℃反应24h后,化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建重链基因库。用SfiI酶切轻链全长基因和载体pDGB-HC-TM,电泳回收目的DNA片段,用上述构建重链基因库同样的方法构建轻链基因库。分别从轻、重链抗体库中各随机挑取10个单克隆,培养过夜后获取质粒,测序分析抗体基因库的质量及多样性。6.初级抗体库在293T细胞表面展示将构建的两个初级抗体库质粒中提,一起瞬时转染293T细胞,用流式细胞仪分析抗体在细胞表面的表达情况。结果与讨论：获得淋巴细胞的数量为1.4×108个。提取获得约3.5μg总RNA,其A260/A280的值为1.90。PCR扩增共获得约2gg的全套IgGl轻链K型全长基因和约2gg的全套重链可变区基因。根据在含有氨苄青霉素抗性的LB平皿上长出的细菌克隆数,计算所构建的抗体重链基因库库容量为1.89×105,背景克隆的比例为3.60%；抗体轻链基因库库容量为6.54x104,背景克隆的比例为1.65%。在轻、重链抗体基因库中各挑取10个单克隆进行测序分析,结果表明重链库的10个单克隆中有8个含有正确的VH编码序列,编码8个特异的氨基酸序列；轻链库的10个单克隆中有7个含有正确的LCK编码序列,编码7个特异的氨基酸序列。将此重链库和轻链库共转染哺乳动物细胞后,理论上抗体库的多样性可以达到6.67x109[(1.89x105×80%)×(6.54x104x70%)]。将两个抗体库共转染293T细胞,可以检测到阳性细胞总量为63.40%,表明抗体库中的全长抗体可以展示在293T细胞的表面,可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。结论：成功采用哺乳动物细胞展示技术,构建了库容量大且多样性好的全长人源轻、重链基因库,可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。二、二级抗体库的构建目的：为了更容易筛选到抗VEGF抗原的抗体,更好地利用贝伐单抗的导向作用。我们将第一部分构建好的轻、重链初级抗体库,分别与通过全基因合成方法合成的贝伐单抗重链、轻链基因进行配对,通过四片段连接插入哺乳动物细胞双表达载体pDGB4,构建两个二级抗体库。实验中将贝伐单抗轻、重链的可变区基因片段通过四片段连接的方法插入pDGB4载体,构建抗体库筛选阳性对照。方法：1.双表达载体pDGB4的制备以BsmBI和SfiI对载体pDGB4进行双酶切,电泳鉴定,并分离纯化5kb和3kb的两段目的DNA片段。2.贝伐单抗序列的合成在贝伐单抗的重链可变区碱基序列前面加上BsmBI的酶切序列以及信号肽序列,以BsmBI进行酶切,电泳分离纯化0.45kb大小的目的DNA片段。在贝伐单抗的轻链可变区碱基序列前面加上SfiI的酶切序列以及信号肽序列,采用重叠延伸PCR方法进行全长轻链的制备,再以SfiI进行酶切,电泳并分离纯化0.75kb的目的片段。3.抗体库基因的制备以已经制备的抗体重链基因库(pDGB-HClib-TM)的细菌沉淀为来源,进行质粒中提,获得抗体重链基因库的质粒DNA；用BsmBI进行酶切,电泳并分离纯化0.45kb的DNA片段。同样的方法,将抗体轻链基因库(pDGB-LClib)用SfiI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.75kb的DNA片段。4.四片段连接构二级建抗体库将经过双酶切的载体pDGB4的3kb,5kb两个目的片段,以及经酶切的重链抗体库0.45kb片段加上贝伐单抗轻链0.75kb片段,4片段按1：1：1：1进行连接。同样的方法将载体的3kb,5kb以及经酶切的轻链抗体库0.75kb和贝伐单抗重链可变区0.45kb片段,4片段按1：1：1：1进行连接。构建含贝伐单抗重链及抗体库轻链的抗体库1,和含贝伐单抗轻链及抗体库重链的抗体库2。将上述两个抗体库化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,计算抗体库的库容量。5.构建质粒pDGB4-avastin将经过双酶切的载体pDGB4的3kb,5kb两个目的片段和经过酶切纯化贝伐单抗重链抗体片段、轻链抗体片段,同时插入到pDGB4载体,化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,随机挑取单克隆,进行扩增培养、小提测序分析。结果与讨论：构建了库容量分别为9×105抗体库1和1.8×106抗体库2,背景克隆的比例分别为0.24%和0.35%。成功构建阳性对照质粒pDGB4-avastin。测序结果表明贝伐单抗轻、重链已经成功插入pDGB4。为下一步稳定转染FCHO细胞,筛选具有能稳定表达抗体并能与VEGF抗原结合的稳定细胞株奠定基础。结论：成功将第一部分构建好的两个初级抗体库基因以及贝伐单抗轻、重链基因通过四片段连接插入哺乳动物细胞双表达载体pDGB4,构建了两个二级抗体库。并构建了阳性对照载体克隆pDGB4-avastin,为特异性抗体的筛选奠定了基础。三、抗VEGF抗体库的展示及初步筛选目的：将第二部分构建好的两个二级抗体库与阳性对照克隆pDGB4-avastin,进行质粒中提,获取的各自的质粒DNA,稳定转染至FCHO,获得稳定展示全长抗体的细胞株。用流式细胞仪进行分选获取能与VEGF抗原特异性结合的细胞。方法：1.全长抗体库以及pDGB4-avastin质粒DNA的制备以已经制备的四片段连接抗体库的细菌沉淀为来源,中提获得质粒DNA。2.稳定转染抗体库的细胞库的库容量将稳定转染四片段连接抗体库质粒DNA的FCHO细胞在含潮霉素B的培养基中持续培养,根据倍比稀释后计数的细胞克隆数量,计算出所获得的细胞库的库容量。3.抗VEGF抗体的富集、筛选常规培养稳定表达全长抗体的细胞库,用不含胰酶的细胞消化液(cell dissociation buffer)进行消化回收后用PE标鼠抗人抗体和Biotinylated Human VEGF试剂盒进行双染,随后经流式细胞分选仪检测、富集、分选表达抗VEGF抗体的FCHO细胞。4.分选的单克隆细胞的流式分析分选获得的单克隆细胞进行扩大培养,使用PE标鼠抗人抗体和Biotinylated Human VEGF试剂盒进行双染,然后用流式细胞仪进行检测,选择存在双阳性信号的细胞株保种,以备后续分析。结果与讨论：将抗体库1及2的质粒DNA稳定转染FCHO细胞。获得了稳定表达的细胞抗体库1,库容量为4.2×105,抗体库2的库容量为3.8×105。经过两轮富集后,细胞表面特异性抗体的表达抗体库1提高了20.7倍,抗体库2提高了7.8倍。经单克隆分选,抗体库1获得49个单克隆,其中8个能与VEGF抗原特异性结合,而抗体库2获得89个克隆,其中18个能表达特异性的抗体。为下一步获取单克隆基因,展开全长人源抗VEGF抗体的筛选奠定了实验基础。结论：成功构建了全长抗VEGF的稳定细胞抗体库,并通过流式分选富集,共获得了26株能与VEGF特异性结合的单克隆细胞株。为后期分析单克隆序列,展开全长人源抗VEGF抗体的筛选以及抗体活性的鉴定奠定了良好的基础。