研究背景1、弥漫性掌跖角皮症的研究背景弥漫性掌跖角皮症(Diffuse Palmoplantar Keratoderma,DPPK),是掌跖角化病的遗传型的一个最常见的类型。弥漫性掌跖角化病属于常染色体显性遗传,可见于所有种族中。本病多为婴儿期开始发病,轻者仅有掌跖皮肤粗糙,重者掌跖处出现弥漫性斑块状、边缘清晰的角质增厚,呈黄色胼胝体样。有时角质增厚可蔓延至掌跖皮肤侧缘或手足背,可伴有指节垫、甲板增厚浑浊、指趾屈曲畸形等。弥漫性掌跖角皮病根据其病理特点可分为弥漫性表皮松解性掌跖角化症(diffuse epidermolytic PPK,DEPPK)和弥漫性非表皮松解性掌跖角化症(diffuse non-epidermolytic PPK,DNEPPK)2种亚型。表皮松解性掌跖角化症(EPPK,OMIM#144200),即弥漫性表皮松解性掌跖角化症(DEPPK),最初由Vorner在1901年报道,是一种常染色体显性遗传病。EPPK与DNEPPK的临床表现相似,均表现为弥漫性的角化过度,但DNEPPK患者的表皮为非松解性,没有角质形成细胞的降解和破裂；EPPK患者表皮为松解性,角质形成细胞大量裂解。而EPPK在各个种族中和临床上更为常见。1992年,Reis等通过对德国1个7代共18例患者的EPPK大家系进行的遗传连锁分析,将EPPK的候选基因定位于染色体17q21.1-q21.2。此部位是Ⅰ型角蛋白基因簇的分布区域,因此,在掌跖表皮中特异性表达的Ⅰ型角蛋白KRT9基因自然地被认为是EPPK的一个候选基因。角蛋白是一类中间纤维蛋白,分子数量多达30多种,可分为2种类型,Ⅰ型为酸性蛋白,Ⅱ型为中性/碱性蛋白。角蛋白分子是表皮细胞和上皮细胞中间纤维的主要成分。因此,角蛋白突变会破坏细胞中间纤维的组装,形成异常的聚集物,从而削弱细胞骨架的力量,增加细胞破裂的风险,引发某些疾病。角蛋白9(KRT9)是工型为酸性蛋白,其几乎局限性表达于掌跖部位的皮肤。因此,KRT9基因的突变与表皮疾病的发生发展关系密切。迄今为止,与EPPK有关的KRT9基因突变据文献所报道的已经多达25种,主要突变方式为错义突变、碱基缺失或插入。2、毛囊角化病的研究背景(1)毛囊角化病的临床特征。毛囊角化病(Keratosis Follicularis, DD)是一种少见的常染色体显性遗传的角化不良性皮肤病。本病出生时无皮疹,通常10-20岁开始发病。男女发病率大致相等。流行病学研究调查表明,发病率1/30,000到1/100,000之间。本病临床表型多样,皮疹分布对称和广泛。皮损多见于前额、头皮、背部等皮脂溢出较多的部位。病情严重时甚至可扩展到躯干、腰骶部和外生殖器等处。皮疹初发常见部位为耳部,面部皮疹常较严重。早期表现为坚实的、红色或正常肤色的小丘疹。丘疹逐渐增大成疣状,逐渐趋向融合,形成不规则的疣状斑块或乳头瘤样增生。皮疹多对称分布,但明显的不对称或带状、痣样分布也可发生。可伴有掌跖角化以及特征性甲的改变。此外还可以累及粘膜,如口咽、食管、喉、肛门直肠粘膜。本病常在夏季加重,阳光、高温、出汗、摩擦等可促发本病的发生或加重本病的病情。毛囊角化实际上并不是一种毛囊性疾病,某些缺乏毛囊的部位,如掌跖和口腔黏膜也可以发病。典型组织病理特征1)特殊形态的角化不良,形成圆体和谷粒2)基底层上棘层松解,形成基底层上裂隙和隐窝3)“绒毛”向上不规则增生,进入隐窝和裂隙内4)有乳头瘤样增生、棘层肥厚和过度角化,真皮慢性炎症性改变。(2)毛囊角化病致病基因的定位克隆。毛囊角化病是1889年由Darier和White首次报告。1993年,Bashir和Craddock等首次将该病的致病基因定位于12q23-q24.1,这正是ATP2A2基因所在位点。已经证实其编码的肌浆/内质网钙离子-ATP酶2(SERCA2)的突变是引起该疾病的主要遗传基础。SERCA2是P型钙离子ATP酶家族成员中的一员,不仅能调节细胞内外钙离子的浓度,而且在维持细胞钙离子信号传导上也起到相当重要的作用。在毛囊角化病患者体内ATP2A2基因编码一种功能缺陷的SERCA2。(3)ATP2A2基因结构、功能及突变。ATP2A2基因长度约为76kb,由21个外显子组成,编码肌浆网/内质网钙离子ATP酶2(SERCA2)。根据剪接部位不同,可编码成三个不同的转录本。分别是主要表达于心脏、脑组织和慢速收缩骨骼肌的SERCA2a;分布于平滑肌、表皮等非肌肉组织中的SERCA2b和在上造血细胞系和单核细胞中检测到的SERCA2c。 SERCA2二级结构包括颈亚区、执行区、磷酸化区、ATP结合区、10或11个跨膜螺旋亚区(M1-10/11)等,跨膜区内M4、M5、M6、M8存在Ca2+的结合部位,铰链区把ATP结合区和跨膜蛋白部分连接起来形成一个完整的功能单位。SERCA2是P型钙离子ATP酶家族成员中的一员,负责调节细胞内外钙离子的浓度,参与机体内钙离子信号的传导,是使得内质网中大量钙离子聚集的离子泵之一。SERCA2通过转运细胞浆内的钙离子至内质网膜上来维持细胞浆内低钙离子水平。细胞浆内钙离子的水平在表皮细胞间的连接和调节细胞分化方面具有重要的作用。ATP2A2基因的突变可引起SERCA2功能紊乱,表现为ATP、钙离子与相应的结合位点结合能力下降,影响ATP的磷酸化作用等。据报道,关于DD的ATP2A2基因的突变在整个基因内散在分布,没有突变热点区域,尽管如此,有研究表示ATP2A2内有两个突变集合区,即是位于基因两端的氨基酸上游的杆状区、S1区和羧基末端跨膜区。然而也有文献报道发现DD突变在ATP2A2基因的中段分布频率较高,尤其是磷酸化区和ATP结合区。目的(1)检测临床上所收集的一个中国掌EPPK家系存在的KRT9基因突变,分析EPPK的临床特点和突变筛查结果,以及EPPK的基因型-表型之间的关系。回顾文献曾报道过的有关EPPK家系的KRT9基因突变的病例,总结分析KRT9基因的突变位点、突变类型及突变的种族来源等方面的特点,以期获得有关KRT9基因和EPPK的更全面的遗传信息。(2)检测我科临床上收集的2例单发毛囊角化病病例,并进行ATP2A2基因致病性突变的检测,分析单发病例的临床特点及突变结果,以期获得更多的有关ATP2A2基因和DD的基因型和表型的相关信息。方法(1)家系调查及病例资料收集：我科临床上收集一个患掌跖角皮症的家系以及2例单发的毛囊角化病病例的临床资料,及进行家系调查。(2)组织病理学检查：在局麻下手术切取EPPK先证者左手掌皮损处的一小块皮肤组织以及毛囊角化病患者2右肩部的皮损组织,然后行常规病理检查。(3)基因组DNA提取：收集一个掌跖角化病家系中先证者及其弟弟的外周血样、该2例的毛囊角化病患者的外周血样及100份正常对照健康人的外周血样,并提取外周血样的DNA。(4)PCR反应：设计扩增KRT9基因突变热点区域——第1个外显子编码区及侧翼序列,设计扩增ATP2A2基因的21个外显子18对引物,然后进行PCR反应。(5)1%琼脂糖凝胶电泳：PCR反应后,DNA产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳,见单一明亮条带时可送DNA测序检测。(6)DNA测序：采用焦磷酸DNA测序法对EPPK患者、毛囊角化病患者以及正常对照患者的DNA进行测序检测,并进行基因突变筛查。(7)对目前国外文献所报道的有关EPPK的角蛋白9基因突变进行总结分析。查阅Human Intermediate Filament Database(http://www.interfil.org/)及美国国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)输入相关检索词,检索到有关国内报道的掌跖角化病的病例报道及相关突变检测,对这些病例KRT9基因的突变位点、突变类型及突变的种族来源等进行分析。结果(1)EPPK家系患者的临床特点：先证者,女性,32岁,出生半个月后双手掌及足底皮肤即出现弥漫分布的红斑、鳞屑。随着年龄的增长,患者掌跖皮肤逐渐增厚,细小或片状脱屑,近端指关节及腕部掌侧皮肤明显增厚、隆起,呈胼胝体样,黄色,质硬；双手指屈曲畸形；趾甲普遍增厚、浑浊,真菌检测阴性。病情冬季加重,皮肤干燥、皲裂、出血,伴明显疼痛；夏季减轻。家系调查：调查了4代共16人,其中患者6人,男性3人,女性3人。最小患病年龄为1岁半,发病年龄均为出生后半个月左右。临床表现均为弥漫性的掌跖皮肤增厚、鳞屑,严重时皮肤干燥、皲裂、疼痛,未见其他部位发病,家族各患病成员的病情轻重相似。(2)通过对KRT9基因的突变热点区域检测,该家系中两名患者的血样被检测出一个错义突变,cDNA的第470位的碱基T变成了G,即c.470T>G,相应的氨基酸由甲硫氨酸变成了精氨酸,即p.M157R。而家系外100位正常人的检测均未发现该突变。(3)通过对目前文献所报道的角蛋白9基因突变的分析,可以发现迄今所报道的KRT9基因突变主要集中在1号外显子和6号外显子,最常见的突变位点为cDNA487位的碱基,即第163位氨基酸。25种突变,19种位于1A区域,6种位于2B区域,除了在cDNA500位点处缺失碱基A插入四个碱基GGCT (c.500delAinsGGCT),即第167位氨基酸酪氨酸转变成色氨酸和亮氨酸(p.Y167delinsWL)外,其余的突变方式均为错义突变。基因型-表型分析显示：文献显示KRT9第163位氨基酸的突变病例均显示出典型的EPPK临床表现和病理表现。此外,KRT1突变也可导致一些与掌跖角皮症相似的临床表现。(4)毛囊角化病患者临床特点：患者1,男性,25岁,来自湖南省,发病年龄较早,5岁时开始发病,病史20年左右。皮疹表现为散在分布于额部、腋窝、腹股沟等处皮肤的红色、粉红色或皮色的坚实的毛囊角化性小丘疹,针尖至粟粒大小,表面油亮,其他等部位皮肤未见累及,不伴有指甲、掌跖及粘膜损害。患者临床表现较轻,一般无自觉症状,但病情反复,冬轻夏重,夏天炎热、多汗时可觉轻度瘙痒。患者2,男性,46岁,来自湖南省,青年时发病,病史20年左右。缘于患者20余年前无明显诱因颈部两侧出现暗红色小丘疹,片状密集分布,无明显自觉症状。皮疹逐渐蔓延至腋下、面、胸背、骶尾部皮肤,可见密集角化性暗红色坚实的毛囊性丘疹,大小不等,局部丘疹增大呈疣状、融合成斑块状,上覆鳞屑。局部皮肤粗糙、肥厚。病情反复发作,夏季加重,冬季可自行缓解。病理特点：表皮角化过度,局部角化不良,棘细胞间松解和裂隙,不正常角化的细胞间可见谷粒和圆体。(5)通过对ATP2A2基因突变检测,2例单发的毛囊角化病病例被检测出两个新的错义突变：c.2098A>G,c.742C>A;相应的苏氨酸变成了丙氨酸,即p.T700A,以及相应的脯氨酸变成了苏氨酸,即p. P248T。而家系外100位正常人的检测均未发现该突变。(6)基因型-表型分析显示：2个单发毛囊角化病病例的突变位点不同,病情严重程度不一,患者的发病年龄也不完全相同。文献分析也表明：即使是同一家系,同一突变也可导致不同表型,发病年龄也有差异。因此未能发现临床表型和基因型之间的明显相关。结论本研究在1个EPPK家系中检测出KRT9基因的1个错义突变,该错义突变为致病性突变而非多态性变化。该2例单发毛囊角化病病例检测出的突变均为致病性突变而非多态性变化,且均为国内外首次报道的新突变。我们的研究结果进一步丰富了有关角化性皮肤遗传病基因型-表型的数据库,为将来的产前遗传咨询、、基因诊断及基因治疗打下基础