苏氨酸是水生动物的必需氨基酸。已有研究表明,苏氨酸缺乏会引起水生动物生产性能下降。水生动物的生长与其对营养物质的消化吸收密切相关,而肠道是营养物质消化吸收的主要场所,肠道结构完整性是肠道功能正常发挥的基础。本研究首先通过动物生长试验考察饲粮苏氨酸对草鱼（Ctenopharyngodon idella）幼鱼生长性能、消化器官发育指数、消化酶和刷状缘酶活力及氨基酸代谢相关酶的影响。其次,在生长试验结束后进行嗜水气单胞菌攻毒实验,一方面,通过考察饲粮不同水平的苏氨酸对幼草鱼肠道抗氧化损伤能力及Nrf2相关信号调控途径的影响,系统探索苏氨酸对草鱼肠道细胞结构完整性的影响;另一方面,通过考察饲粮苏氨酸对幼草鱼肠道紧密连接和PKC家族相关信号调控途径的影响,系统探索苏氨酸对草鱼肠道细胞间结构完整性的影响。第三,建立草鱼原代肠上皮细胞（IECs）氧化损伤模型,考察苏氨酸对草鱼IECs氧化损伤和抗氧化能力的影响,探索Nrf2信号通路在苏氨酸调控鱼类IECs抗氧化能力中的作用;进一步通过对Muc2、Muc3、TDH和Gal NT2等苏氨酸代谢相关基因进行沉默,考察苏氨酸对草鱼IECs结构完整性影响的可能作用途径。第四,建立草鱼IECs紧密连接破坏模型,考察苏氨酸对草鱼IECs跨膜电阻、细胞通透性和紧密连接蛋白的影响,结合PKC信号阻断和干扰试验,探索苏氨酸调控草鱼IECs间紧密连接结构完整性的信号机制;进一步通过对Muc2、Muc3、TDH和Gal NT2等苏氨酸代谢相关基因的沉默,探索苏氨酸调控草鱼IECs间紧密连接结构完整性的可能作用机制。主要研究内容和结果如下:1.苏氨酸对幼草鱼生产性能、消化吸收和氨基酸代谢的影响试验方法:选取1080尾健康草鱼（9.53±0.02 g）,随机分为6个处理,每个处理3个重复。各处理组饲喂的饲粮苏氨酸水平分别为:3.99,7.70,10.72,14.10,17.96和21.66g/kg。动物生长试验周期为8周。主要研究结果如下:研究结果发现,与苏氨酸缺乏组（3.99g/kg）相比,适宜水平的苏氨酸显著提高了幼草鱼的末重、增重百分比、特定生长率、摄食量和饲料效率（P＜0.05）。同时,适宜水平的苏氨酸显著增加幼草鱼肠重、肠重指数,肠长和肠长指数（P＜0.05）,明显改善了幼草鱼肠道的形态结构。适宜水平的苏氨酸显著提高鱼体的水分,粗蛋白,粗脂肪和钙含量,以及蛋白沉积率、脂肪沉积率和灰分沉积率,显著降低鱼体中的粗灰分含量（P＜0.05）。以特定生长率（SGR）为标识,利用二次回归模型,确定草鱼幼鱼（9.53-53.43g）苏氨酸需要量为14.53g/kg饲料（4.48 g苏氨酸/100 g蛋白）。同时,适宜水平的苏氨酸显著增加幼草鱼肝胰脏和肠道中的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力,显著提高前、中和后肠Na+-K+-ATPase酶（NKA）、碱性磷酸酶（AKP）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）和肌酸激酶（CK）的活力（P＜0.05）;显著增加肝胰脏和肌肉中谷草转氨酶（GOT）和谷丙转氨酶（GPT）的活力,降低血浆氨的含量（P＜0.05）;显著上调肝胰脏和前、中和后肠苏氨酸脱氢酶（tdh）和N-乙酰氨基半乳糖转移酶2（galnt2）,仅肝脏中苏氨酸脱水酶（thal）的基因表达（P＜0.05）,而对苏氨酸醛缩酶（tha）无影响（P＞0.05）;显著上调前、中和后肠粘蛋白2（Muc2）和粘蛋白3（Muc3）的基因表达。表明,适宜水平的苏氨酸能促进幼草鱼的生长,消化吸收和氨基酸代谢。2.苏氨酸对幼草鱼肠道结构完整性的影响肠道结构是肠道功能的基础。为系统探究苏氨酸对水生动物肠道结构的影响,在生长试验结束后开展了试验二,用嗜水气单胞菌进行攻毒14天,研究苏氨酸对幼草鱼肠道细胞结构完整性和细胞间紧密连接的影响。研究结果发现,适宜水平的苏氨酸显著降低了幼草鱼前、中和后肠活性氧（ROS）,丙二醛（MDA）和蛋白质羰基（PC）的含量,提高抗超氧阴离子自由基（ASR）、抗羟自由基（AHR）、铜和锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的活力和还原性谷胱甘肽（GSH）的含量（P＜0.05）,但对锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的活力没有影响（P＞0.05）。与此同时,适宜水平的苏氨酸能够显著上调前、中和后肠抗氧化酶亚型Cu/Zn-SOD（而不是Mn-SOD）、CAT、GPX1a、GPX4a、GPX4b、GSTR和GR,中、后肠的GSTO1和GSTO2基因表达（P＜0.05）,而对前肠没有影响（P＞0.05）。进一步研究发现,适宜水平的苏氨酸显著增加了幼草鱼肠道核Nrf2的蛋白水平,并下调了Keap1a（而不是Keap1b）亚型基因表达（P＜0.05）。表明,苏氨酸可能通过Keap1a/Nrf2信号,调控肠道抗氧化酶及其亚型基因表达,增加相应酶的活力和非酶类抗氧化物质GSH含量,从而维持草鱼肠道细胞结构的完整性。本研究结果还发现,适宜水平的苏氨酸显著上调了幼草鱼前、中和后肠闭合蛋白Occludin,支架蛋白（zonula occludens 1/2,ZO-1/2）,离子通道蛋白Claudin-b、-c、-3、-7a、-7b和-12的基因表达（P＜0.05）,但不影响Claudin-15b的基因表达（P＞0.05）;显著下调了幼草鱼前肠Claudin-15a的基因表达（P＜0.05）,但对中、后肠无影响（P＞0.05）。进一步研究发现,适宜水平的苏氨酸显著增加了幼草鱼前、中和后肠中膜结合的PKC（α、β2、ε、δ）亚型的蛋白表达（P＜0.05）,而对PKC（β1、γ、θ、η、ζ、μ、ι）无影响（P＞0.05）。表明,苏氨酸可能通过激活PKC（α、β2、ε、δ）来调节紧密连接蛋白的表达,从而维持草鱼肠道紧密连接结构的完整性。3.苏氨酸调控草鱼IECs结构完整性的作用及作用机制试验二的中的体内试验的研究结果表明,苏氨酸能够维持肠道细胞结构的完整性。然而,其是否通过相关信号的调控以及以怎样的方式调节相关信号途径尚不清楚。因此,本研究通过过氧化氢（H2O2）诱导建立草鱼IECs氧化损伤模型,围绕苏氨酸对草鱼IECs抗氧化的影响,开展了试验三。试验三共包含三个部分。3.1苏氨酸对草鱼IECs结构完整性的影响第一部分共设计7个处理组,分别为空白对照组:Ctrl（Thr:0m M,H2O2:0μM）、H2O2诱导组:H2O2（Thr:0m M,H2O2:100μM）和H2O2诱导12h后培养液中添加不同浓度的苏氨酸进行48h培养的处理组:T0.5、T1.0、T1.5、T2.0和T2.5（Thr:0.5,1.0,1.5,2.0和2.5m M）,每个处理组6个重复。研究结果发现,与Ctrl组相比,H2O2组显著增加了细胞MDA和PC,降低了T-SOD、GR的活力和GSH含量,增加了CAT和GPX的活力（P＜0.05）;显著上调了抗氧化酶Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPX1a、GPX1b、GPX4a、GPX4b和GR的基因表达（P＜0.05）。与H2O2组相比,2.0m M的Thr显著降低了细胞MDA和PC,增加了GSH含量,提高了T-SOD、CAT、GPX和GR的活力,并显著上调了Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1a、GPX4a、GPX4b和GR基因表达（P＜0.05）,但对Mn-SOD和GPX1b无影响（P＞0.05）。表明,苏氨酸能够通过增强草鱼IECs的抗氧化能力,从而缓解过氧化氢引起的氧化损伤。3.2苏氨酸对草鱼IECs结构完整性作用的信号调控机制第二部分,为探讨苏氨酸对草鱼IECs结构完整性作用的信号调控机制,共设计5个处理组,分别为空白对照组:Ctrl（Thr:0m M,H2O2:0μM）、H2O2诱导组:H2O2（Thr:0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导12h后培养液中添加适宜水平的苏氨酸处理组:Thr（Thr:2.0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导12h后在不含苏氨酸的培养液中添加Nrf2抑制剂组:ML385（Thr:0m M,ML385:10μM）和H2O2诱导12h后在含适宜水平的苏氨酸培养液中添加Nrf2抑制剂组:ML385+Thr（Thr:2.0m M,ML385:10μM）,每个处理组6个重复。研究结果发现,Nrf2抑制剂（ML385）显著抑制了苏氨酸减少的MDA和PC含量,提高的T-SOD、CAT、GPX、GR活力和GSH含量,以及上调的Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1a、GPX4a、GPX4b和GR的基因表达（P＜0.05）。表明,苏氨酸能通过激活Nrf2信号增强草鱼IECs抗氧化酶及其亚型的转录,进而增加其相应活力和非酶类抗氧化物质含量,从而提高IECs的抗氧化。3.3苏氨酸对草鱼IECs结构完整性信号调控的作用方式第三部分,为深入探讨苏氨酸对调控草鱼IECs细胞结构完整性作用的信号作用方式,共含有5个细胞实验,每个细胞实验设计5个处理组,分别为空白对照组:Ctrl（Thr:0m M,H2O2:0μM）、H2O2诱导组:H2O2（Thr:0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导12h后培养液中添加适宜水平的苏氨酸处理组:Thr（Thr:2.0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导12h后在不含苏氨酸的培养液中si RNA转染组:si RNA（Thr:0m M,si RNA:10n M）和H2O2诱导12h后在含适宜苏氨酸水平的培养液中si RNA转染组:si RNA+Thr（Thr:2.0m M,si RNA:10n M）,每个处理组6个重复。研究结果发现:第一,si Muc2/3转染显著抑制了苏氨酸减少的细胞MDA和PC,提高的GSH含量,T-SOD、CAT、GPX、GR的活力以及上调的Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1a、GPX4a、GPX4b和GR基因表达（P＜0.05）。进一步研究发现,si Muc3（而不是si Muc2）显著抑制了苏氨酸增加的核内Nrf2的蛋白表达（P＜0.05）;结合试验四的结果发现,Nrf2抑制剂（ML385）不能够显著抑制苏氨酸上调的Muc2/3基因表达（P＞0.05）。表明,Muc3（而不是Muc2）介导了苏氨酸以Nrf2依赖的作用方式,增强草鱼IECs的抗氧化酶及其亚型的基因转录,进而增加其抗氧化酶的活力和非酶类抗氧化物质的含量,从而维持IECs的结构完整性。第二,si Gal NT2/TDH转染能显著抑制了苏氨酸减少的细胞MDA和PC含量。si Gal NT2转染显著抑制了苏氨酸增加的T-SOD、CAT、GPX、GR活力和GSH含量,以及上调的Cu/Zn-SOD、CAT、GPX1a、GPX4a、GPX4b和GR基因表达（P＜0.05）,而si TDH仅显著抑制了苏氨酸增加的GR活力以及GSH含量,上调的GPX1a和GR基因表达（P＜0.05）,但不能够显著抑制苏氨酸增加的T-SOD、CAT和GPX活力,以及上调的Cu/Zn-SOD、CAT、GPX4a和GPX4b基因表达（P＞0.05）。同时,进一步地研究发现,si Gal NT2（而不是si TDH）转染显著抑制了苏氨酸增强的核内Nrf2的蛋白表达（P＜0.05）。表明,苏氨酸能够通过TDH介导的苏氨酸分解代谢,以Nrf2非依赖的信号调控方式改善草鱼IECs的抗氧化状态;也能够通过Gal NT2介导的粘蛋白合成代谢,以Nrf2依赖的信号调控方式增强草鱼IECs的抗氧化能力,从而维持IECs的结构完整性。4.苏氨酸调控草鱼IECs间紧密连接结构完整性的作用及作用机制根据试验二的体内试验研究结果表明,苏氨酸能够影响肠道紧密连接结构的完整性。然而,其是否通过相关信号的调控以及以怎样的方式调节相关信号途径尚不清楚。因此,本研究利用H2O2诱导建立的草鱼IECs紧密连接破坏模型,围绕苏氨酸对草鱼IECs细胞间紧密连接的影响,开展了试验四。试验四共分四个部分:4.1苏氨酸对草鱼IECs细胞间结构完整性的作用第一部分,共设计7个处理组,分别为空白对照组:Ctrl（Thr:0m M,H2O2:0μM）、H2O2诱导组:H2O2（Thr:0m M,H2O2:100μM）和H2O2诱导4h后在培养液中添加不同浓度的苏氨酸分别进行6-48h培养的苏氨酸处理组:T0.5,T1.0,T1.5和T2.0（Thr:0.5,1.0,1.5,2.0和2.5m M）,每个处理组6个重复。研究结果发现,与Ctrl组相比,H2O2处理IECs 4h显著降低了跨膜电阻（TER）,增加了细胞对FITC-葡聚糖（4KD）的内流率（P＜0.05）,但并没有引起细胞氧化损伤（MDA和PC含量的变化）和细胞存活力（MTT）的变化（P＞0.05）,成功构建了草鱼IECs紧密连接结构破坏模型。同时,与H2O2组相比,在H2O2诱导4h之后,2.0m M的苏氨酸处理IECs在t≥36h时显著增加了TER并降低FITC-葡聚糖（4KD）的内流率（P＜0.05）。与Ctrl组相比,H2O2处理IECs 4h显著下调了紧密连接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-b、-c和-2,上调Claudin-12、-7a、-7b、-15a和-15b基因表达（P＜0.05）。而与H2O2组相比,2.0m M的苏氨酸处理48h之后,显著上调了Occludin、ZO-1、Claudin-b和Claudin-c和下调了Claudin-7a、-7b和-15a基因表达（P＜0.05）,但对Claudin-2、-12和-15b无影响（P＞0.05）。表明,苏氨酸能够通过差异化地调节草鱼IECs紧密连接蛋白的表达来降低细胞的通透性,从而维持IECs紧密连接结构的完整性。4.2苏氨酸对草鱼IECs细胞间紧密连接结构完整性作用的信号机制第二部分,共设计5个处理组,分别为空白对照组:Ctrl（Thr:0m M,H2O2:0μM）、H2O2诱导组:H2O2（Thr:0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导4h后培养液中添加适宜水平的苏氨酸处理组:Thr（Thr:2.0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导4h后在不含苏氨酸的培养液中添加PKC抑制剂LY333531组:LY333531（Thr:0m M,LY333531:1μM）和H2O2诱导4h后在含适宜苏氨酸水平的培养液中添加PKC抑制剂LY333531组:LY333531+Thr（Thr:2.0m M,LY333531:1μM）,每个处理组6个重复。研究结果发现,PKC抑制剂LY333531显著抑制了苏氨酸上调的Occludin、ZO-1和Claudin-c（P＜0.05）,但不能够抑制苏氨酸上调的Claudin-b、-7a、-7b和-15a基因表达（P＞0.05）。表明,苏氨酸能够通过激活PKC信号选择性地调节草鱼IECs紧密连接蛋白的表达,从而维持IECs紧密连接结构的完整性。第三部分,共包含4个细胞试验,每个试验设计5个处理组,分别为空白对照组:Ctrl（Thr:0m M,H2O2:0μM）、H2O2诱导组:H2O2（Thr:0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导4h后培养液中添加适宜水平的苏氨酸处理组:Thr（Thr:2.0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导4h后在不含苏氨酸的培养液中si RNA转染组:si RNA（Thr:0m M,si RNA:10n M）和H2O2诱导4h后在含适宜苏氨酸水平的培养液中si RNA转染组:si RNA+Thr（Thr:2.0m M,si RNA:10n M）,每个处理组6个重复。研究结果发现,si PKCα（而不是si PKCβ2）转染显著抑制了苏氨酸上调的Occludin和ZO-1（P＜0.05）,但不能显著抑制苏氨酸上调的Claudin-c基因表达（P＞0.05）;si PKCε/δ转染均能够显著抑制苏氨酸上调的Occludin、ZO-1和Claudin-c基因表达（P＜0.05）。表明,苏氨酸能够通过激活PKC（α、ε、δ）亚型选择性地调节草鱼IECs紧密连接蛋白的表达,从而维持IECs紧密连接结构完整性。4.3苏氨酸对草鱼IECs细胞间紧密连接结构完整性信号调控的作用方式为进一步深入探讨苏氨酸对草鱼IECs细胞间紧密连接结构完整性信号调控的作用方式,开展了第四部分的试验。第四部分共含4个细胞实验,每个实验设计5个处理组,分别为空白对照组:Ctrl（Thr:0m M,H2O2:0μM）、H2O2诱导组:H2O2（Thr:0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导4h后培养液中添加适宜水平的苏氨酸处理组:Thr（Thr:2.0m M,H2O2:100μM）、H2O2诱导4h后在不含苏氨酸的培养液中si RNA转染组:si RNA（Thr:0m M,si RNA:10n M）和H2O2诱导4h后在含适宜苏氨酸水平的培养液中si RNA转染组:si RNA+Thr（Thr:2.0m M,si RNA:10n M）,每个处理组6个重复。研究结果发现:第一,si Muc2/3转染能够显著抑制苏氨酸上调的Occludin,ZO-1和Claudin-c的m RNA水平（P＜0.05）,但si Muc3（而不是si Muc2）显著抑制了苏氨酸下调的Claudin-7a、-7b和-15a基因表达（P＞0.05）;进一步地研究发现,si Muc3（而不是si Muc2）转染显著抑制了苏氨酸增加的PKCα、-ε和-δ的蛋白表达（P＞0.05）,同时PKC抑制剂LY333531显著抑制了苏氨酸上调的Muc2/3基因表达（P＜0.05）。表明,Muc3（而不是Muc2）介导了苏氨酸以PKC（α、ε、δ）依赖的作用方式调节了草鱼IECs紧密连接蛋白的表达,从而维持IECs紧密连接结构的完整性。第二,si Gal NT2（而不是si TDH）转染显著抑制了苏氨酸上调的Occludin、ZO-1、Claudin-b和Claudin-c,和下调的Claudin-7a、-7b和-15a的基因表达（P＞0.05）。进一步地研究发现,si Gal NT2（而不是si TDH）转染显著抑制了苏氨酸增加的PKCα、-ε和-δ的蛋白表达（P＜0.05）。表明,Gal NT2参与的粘蛋白合成代谢,而不是TDH参与的苏氨酸氧化分解代谢介导了苏氨酸激活PKC（α、ε、δ）亚型,从而调节草鱼IECs紧密连接蛋白的表达,维持IECs紧密连接结构的完整性。综上所述,苏氨酸能够促进幼草鱼的生长,这与其增强的肠道消化吸收、氨基酸代谢和粘蛋白合成等肠道功能有关。苏氨酸通过提高肠道的抗氧化能力和增强肠道的紧密连接,维持了肠道细胞结构完整性和细胞间紧密连接结构的完整性。苏氨酸通过上调Gal NT2介导合成的Muc3（而不是Muc2）,激活Nrf2信号途径,从而增加抗氧化酶基因表达和相应酶的活力,以及非酶类抗氧化物的含量,进而维持草鱼肠道细胞结构的完整性。苏氨酸通过上调Gal NT2介导合成的Muc3（而不是Muc2）,激活PKC（α、ε、δ）信号途径,从而调节紧密连接蛋白的表达,进而维持草鱼肠道紧密连接结构的完整性。以SGR和前肠MDA含量为标识,分别确定了幼草鱼（9.53-53.43g）苏氨酸需要量及改善肠道健康的最适苏氨酸水平分别为14.53g/kg饲料（4.48g苏氨酸/100g蛋白）和15.41g/kg饲料（4.76g苏氨酸/100g蛋白）。