论文部分内容阅读
牦牛主要分布在青藏高原地区,该地区气候环境极其恶劣,冷季枯草期漫长,造成高原饲草料季节性缺乏,牦牛在冷季长期处于营养缺乏状态。而该季节既是新生犊牛哺乳阶段又是当年配种母牛妊娠阶段,犊牛早期营养摄入的缺乏易导致后期生长发育迟缓。课题组前期转录组研究发现生长迟缓牦牛瘤胃上皮细胞连接结构及免疫炎症等功能与正常牦牛存在差异;此外,屠宰试验发现生长迟缓牦牛胃肠道各段重量低于正常牦牛,说明生长迟缓牦牛胃肠道发育不良,而谷氨酰胺（Gln）已被证实可用于缓解猪禽多种生理应激,促进肠道发育。因此,本研究通过三个试验深入比较了生长迟缓和正常牦牛胃肠道发育差异,包括瘤胃和肠道屏障功能、组织炎症反应及细菌群落结构,并研究了添加Gln对生长迟缓牦牛的促生长作用。试验一生长迟缓牦牛和正常牦牛胃肠道发育差异比较根据课题组前期研究,选择牦牛体重（BW）处于同品种、同年龄群体BW最低10%以下的个体为生长迟缓牦牛。选取8头年龄和BW（74.00±6.41 kg）相近的青海高原型生长迟缓牦牛公牛作为迟缓组（GRY）,并选择8头年龄相近、生长发育良好的青海高原型正常牦牛（BW=111.63±4.03 kg）公牛作为正常组（GNY）。所有牦牛在相同环境下饲养60天,之后进行屠宰采集试验样品。结果表明:（1）GRY组平均日增重（ADG）和胃肠道各段重量显著低于GNY组,瘤胃上皮乳头高度、空肠绒毛高度和表面积及回肠绒毛表面积和绒毛高度/隐窝深度均显著低于GNY组,而渗透进入血液的消化道有害物质二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）及脂多糖（LPS）含量显著高于GNY组（P＜0.05）。（2）GNY组瘤胃中纤维降解菌Ruminococcaceae NK4A214 group、Ruminococcaceae UCG-014及Treponema 2丰度显著高于GRY组（P＜0.05）。在空肠,GRY组unclassified Chitinophagaceae丰度显著高于GNY组,而unclassified Peptostreptococcaceae、Romboutsia、Ruminococcaceae NK4A214 group及Lachnospiraceae NK3A20 group丰度低于GNY组（P＜0.05）。GNY组回肠中Rikenellaceae RC9 gut group和Prevotellaceae UCG-004丰度高于GRY组（P＜0.05）。此外,相比于GRY组,反映饲料利用率的厚壁菌门/拟杆菌门在GNY组空肠更高（P＜0.05）。（3）相比于GNY组,GRY组瘤胃上皮IL-1β、IL-6及TNF-α的m RNA表达量显著升高,Claudin-1、Claudin-4、Occludin及ZO-1的m RNA和蛋白表达水平明显降低,JNK、p38、ERK1/2及NF-κB p65磷酸化水平显著升高（P＜0.05）;GRY组空肠黏膜IL-1β和IL-6的m RNA表达量显著上调,Claudin-1、Occludin及ZO-1的m RNA和蛋白表达量显著下调,JNK、ERK1/2和NF-κB p65磷酸化水平显著上调（P＜0.05）;GRY组回肠IL-1β和TNF-α的m RNA表达量显著升高,而Claudin-1和ZO-1的m RNA和蛋白表达量显著降低,NF-κB p65磷酸化水平明显提高（P＜0.05）。此外,GRY组空肠和回肠黏膜分泌型免疫球蛋白A（SIg A）含量显著低于GNY组（P＜0.05）。（4）GNY组血清、瘤胃上皮、空肠及回肠黏膜Gln含量显著高于GRY组（P＜0.05）。此外,血清和胃肠道组织中的Gln含量与瘤胃乳头高度、表面积及肠道绒毛高度、宽度存在正相关关系。以上结果表明与正常牦牛相比,生长迟缓牦牛机体Gln含量较低,胃肠道中与低聚糖、淀粉和纤维素降解相关细菌的相对丰度较低;胃肠道上皮JNK、ERK1/2及NF-κB p65磷酸化水平显著上调,屏障功能受损,消化道内有害物质入侵胃肠道组织,出现炎症反应,破坏上皮形态结构,影响其发育。试验二谷氨酰胺对生长迟缓牦牛生长性能、瘤胃发酵及血液指标的影响本试验选取32头年龄（16月龄）和BW（74.03±6.16 kg）相近的青海高原型生长迟缓牦牛公牛随机分为四组。其中一组作为负对照组（NCON）,饲喂基础日粮,其余三组分别为Gln1、Gln2及Gln3组,在饲喂基础日粮基础上每组每头牦牛分别依次添加60、120及180 g/d的Gln。并选择8头年龄（16月龄）相近、生长发育良好的青海高原型正常牦牛（BW=111.75±6.11 kg）公牛作为正对照组（PCON）,饲喂基础日粮。所有牦牛有15天适应期,之后进行90天正式试验。结果表明:（1）Gln2组ADG最高,显著高于其他各组,并且超过正常牦牛（P＜0.05）。Gln三组料重比显著低于NCON组（P＜0.05）,其中Gln2组料重比最低。以ADG和料重比为指标回归分析,Gln适宜添加量分别为114.43 g/d、120.78 g/d。（2）Gln2组微生物蛋白和丁酸含量显著高于NCON组（P＜0.05）,而氨态氮和LPS含量及乙酸/丙酸在两组间呈现相反趋势。Gln2组CP消化率显著高于NCON组,而NDF消化率显著高于NCON和Gln3组（P＜0.05）。（3）在试验第90天,Gln1和Gln2组血清尿素氮含量显著低于NCON和PCON组（P＜0.05）。Gln2和Gln3组血清GSH-Px含量显著高于NCON组（P＜0.05）,而MDA则呈相反趋势。与NCON组相比,Gln2组血清Ig A、Ig G、Ig M和IL-10含量显著升高,而TNF-α、IL-1β及IL-6含量显著降低（P＜0.05）。添加Gln显著降低了生长迟缓牦牛血清DAO和LPS含量（P＜0.05）。以上结果表明添加Gln可增强生长迟缓牦牛机体免疫力和抗氧化能力,提高营养物质消化率,改善瘤胃发酵,从而提高生长迟缓牦牛的生长性能。试验三谷氨酰胺对生长迟缓牦牛胃肠道形态结构、屏障功能及细菌群落组成的影响本试验选取试验二Gln组中生长性能最佳组（Gln2）和对照组（NCON）进行试验,每组选择6头接近组平均BW的牦牛进行屠宰取样分析。结果表明:（1）相比于NCON组,Gln2组屠宰率和回肠重显著升高,瘤胃上皮乳头表面积、空肠绒毛高度和表面积、回肠绒毛表面积和绒毛高度/隐窝深度显著提高,瘤胃纤维素酶及空肠和回肠糜蛋白酶活性显著升高（P＜0.05）。（2）Gln2组瘤胃[Eubacterium]coprostanoligenes group和Ruminococcaceae UCG-010相对丰度显著高于NCON组（P＜0.05）。与Gln2组相比,空肠unclassified Chitinophagaceae、Christensenellaceae R-7 group和[Eubacterium]coprostanoligenes group相对丰度在NCON组显著升高,而unclassified Peptostreptococcaceae、Romboutsia及Lachnospiraceae NK4A136 group相对丰度在NCON组显著降低（P＜0.05）。（3）相比于NCON组,Gln2组瘤胃上皮IL-1β和IL-6的m RNA表达量显著下调,Claudin-1、Occludin及ZO-1的m RNA和蛋白表达量显著上调,而JNK、ERK1/2及NF-κB p65磷酸化水平显著下调（P＜0.05）;Gln2组空肠和回肠黏膜TNF-α的m RNA表达量显著降低,ZO-1的m RNA和蛋白表达量显著升高,而JNK和NF-κB p65磷酸化水平显著降低（P＜0.05）。此外,添加Gln可明显促进生长迟缓牦牛肠道黏膜SIg A分泌（P＜0.05）。（4）相比于NCON组,添加Gln显著提高瘤胃上皮和食糜、空肠黏膜和食糜以及回肠黏膜和食糜Gln含量（P＜0.05）。瘤胃细菌Ruminococcaceae UCG-010和Lachnospiraceae NK4A136 group丰度以及Claudin-1、Occludin和ZO-1表达量与乳头高度和表面积呈正相关,而IL-1β和IL-6表达量与乳头高度和表面积呈负相关。空肠细菌unclassified Chitinophagaceae丰度和IL-1β表达量与绒毛高度、宽度及表面积呈负相关,而Romboutsia、unclassified Lachnospiraceae、Claudin-1、Claudin-4和ZO-1则相反。回肠细菌[Eubacterium]tenue group及Romboutsia丰度和Claudin-1和ZO-1表达量与绒毛高度、宽度及表面积呈正相关,而IL-1β和TNF-α则相反。以上结果表明,添加Gln可提高瘤胃和肠道食糜和组织中Gln含量,增强胃肠道屏障功能,缓解炎症反应,改善菌群结构,从而促进生长迟缓牦牛胃肠道发育。综上所述,生长迟缓牦牛胃肠道屏障功能受损,与低聚糖、淀粉和纤维素降解相关细菌的丰度低于正常牦牛,消化道内有害物质入侵上皮组织进入血液循环,造成炎症反应,破坏胃肠道上皮形态结构,从而影响胃肠道发育。生长迟缓牦牛胃肠道组织和血液Gln含量低于正常牦牛,添加Gln可通过降低胃肠道组织JNK、ERK1/2及NF-κB p65磷酸化水平抑制MAPK和NF-κB信号通路上调紧密连接蛋白表达,下调炎症因子表达,从而增强胃肠道屏障功能,缓解组织炎症反应,改善胃肠道形态结构,促进其发育。此外,添加Gln可提高瘤胃纤维素降解菌[Eubacterium]coprostanoligenes group和Ruminococcaceae UCG-010及肠道unclassified Peptostreptococcaceae和Romboutsia相对丰度,增强消化酶活性,提高消化率,从而提高生长迟缓牦牛生长性能。