背景脑血管病已经成为全球前三位的致死性疾病和首位的致残性疾病,65岁以上的人群中有超过70%的人曾经历过一次卒中发作,随着社会老龄化的加快,患病人数还会继续增加,其中缺血性脑卒中占85%。缺血性脑卒中的病理生理机制很复杂,但现在的研究认为脑缺血损伤和炎症是病情进展的原因。脑组织供血中断数秒内就快速启动缺血级联反应,最终导致梗死核心区细胞膜破坏、神经元死亡,其周围大片缺血但未死亡的区域叫半暗带,如能快速恢复血流,半暗带可以挽救。重度的脑血流低灌注,导致兴奋毒性和过氧化损害,依次引起微血管损伤、血脑屏障破坏,然后启动缺血后炎症反应,加重脑缺血损伤并导致永久性脑组织损害。TLRs是最重要的模式识别受体家族之一,TLRs有富含亮氨酸重复序列的胞外区,用来识别模式相关分子病原,同时具有胞内TIR结构域,用以启动细胞内信号传导。近来得研究证实尤其是TLR4在脑缺血后的炎症应答和炎症介质的产生中起关键作用。在TLR4基因缺陷的小鼠中脑梗死后脑损伤和神经功能损伤程度较野生型小鼠明显减轻。TLR4激活后引起NF-κB核转移,即TLR4/NF-KB信号可诱导TNF-α、IL6等炎性因子表达,产生炎症反应；此外,有研究证实脂多糖可诱导BIT,通过负反馈环路抑制TLR4/NF-κB信号系统,使TLR4-TIRF信号周增强表达了抗炎症因子IFN-β,使得炎症反应减轻,产生BIT。因此,利用IPC制作pMCAO模型,探讨IPC对脑梗死后TLR4信号轴相关炎性因子的表达特点,对进一步明确BIT的内在保护机制,为脑梗死的治疗提供新的策略有着重要的意义。方法1.实验采用SD大鼠,分为实验组(IPC+pMCAO),对照组(SS+pMCAO),假手术组(SS+SS)。2. IPC10min作缺血预处理,48h后制作脑梗死模型pMCAO。3. Longa5分法评价pMCAO后神经功能评分和24h后脑组织损伤程度。4.干湿重法脑含水量和脑梗塞面积。5.RT-PCR技术测定pMCAO后6h,12h,24h,48h,72h共5个时间点TLR4mRNA, NF-κB p65mRNA。6.免疫组化技术测定pMCAO后6h,12h,24h,48h,72h共5个时间点TLR4,NF-κB, TRIF。7. ELISA技术测定pMCAO后6h,12h,24h,48h,72h共5个时间点TNF-a的表达。结果1.结果表明,实验组神经功能评分明显轻于对照组(P<0.01)2.实验组脑组织学缺血损害程度明显较对照组减轻,炎症细胞浸润减少3.脑含水量、脑梗死面积均小于对照组(P<0.01)4. RT-PCR测定结果发现实验组和对照组TLR4mRNA, NF-κB p65mRNA均于6h可见表达,24h达高峰,此后表达逐渐下降,实验组较对照组表达明显减少。5.免疫组化则见对照组个时间点TLR4、NF-κB、TRIF表达高于实验组。6.ELISA分析示实验组个时间点TNF-a含量明显低于对照组。以上组间比较均有统计学差异(P<0.01)。结论1.本研究证实IPC能明显减轻脑梗死后的脑组织炎性反应,缩小脑梗死面积,诱导了BIT的产生。2.IPC抑制pMCAO后TLR4/NF-κB信号的转导,减少了炎性细胞因子的产生。3.此外还通过负反馈机制上调了TRIF活性,增加了抗炎性因子IFN-p的生成,减轻了严重缺血后脑炎性组织损害的程度。4.IPC通过抑制JTLR4/NF-κB炎性信号通路、激活TRIF通路使得促炎性因子生成减少、抗炎性因子生成增加是产生BIT的重要机制。5.研究证明TLR4炎症信号通路激活对脑缺血损伤起关键作用,并参与了BIT的诱导过程6.TLR4信号通路的干预将为急性脑卒中的治疗提供新的策略。已有文献大量研究表明IPC能诱导BIT产生,但对pMCAO后TLR4信号轴炎性因子表达的影响研究不多。虽然BIT的确切分子机制并不明确,但是已初步证实需要新的蛋白质合成、促炎症转录因子NF-κB的激活、诱导TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性细胞因子的产生。小剂量的LPS预处理能够阻止MCAO后脑组织和周围血的细胞炎性反应,抑制中性粒细胞在缺血脑组织浸润和小胶质细胞/巨噬细胞的激活,减少脑缺血后TNF-α等的神经毒性作用,因此LPS预处理是脑梗死治疗的潜在的有效方法。TLR4在脑缺血后炎性损伤的重要作用有助于明确LPS预处理的神经保护机制。TLR4/NF-κB信号轴通过负反馈调节环路使得LPS预处理后的信号传导减弱,该环路主要是阻止TLR4-MyD88司的作用,于是TLR4向NF-κB的信号传导受到抑制,减少了炎性细胞因子的生成；同时再次暴露于LPS损伤时发现TLR4-IRF3轴的信号传导增加,促进抗炎性因子IFN-β的释放。与之相似,CpG预处理可通过TLR9信号轴引起同样的抗炎症反应,诱导脑缺血耐受,并且二者存在交叉耐受,推测LPS和CpG预处理存在共同的作用机制。因此在缺血性卒中前给与TLR预刺激可能重新编程缺血诱导的TLR激活,可以认为LPS和CpG预处理可分别引起TLR4和TLR9的激活,引起轻微的炎症反应,生成少量TNF-α,此时细胞通过表达TLR/NF-κB信号轴负反馈抑制因子来调节炎症应答,只识别轻微脑缺血后产生的内源性TLR配体,在这种新的细胞环境下,再次刺激激活的TLR如TLR4或者TLR9则被阻止,不能激活NF-κB诱导的信号通路,减轻了脑缺血损伤；同时缺血诱导的TLR4或TLR9信号从NF-κB诱导转移到IRF3诱导,生成下游产物抗炎性因子IFN-β。因此,针对TLRs及其相关信号传导通路的干预即在脑缺血前激活TLRs有可能成为脑梗死治疗的潜在策略。除了LPS和CpG,TLRs的外源性配体HMGB1,同样证明在小鼠脑缺血性卒中模型中,在腹腔注射HMGB1抗体能明显减轻脑的缺血性损伤。脑缺血性损伤的病理生理机制非常复杂,临床治疗手段也非常有限,目前也只有一种药物即用于溶栓治疗的重组纤溶酶原激活剂(r-tPA)被证实有效,但是应用时间窗很短(3小时),存在脑出血(6%)和再灌注损伤等并发症,而绝大多数的急性缺血性卒中(AIS)患者不能再3小时内赶到医院,从而不能应用r-tPA溶栓治疗。因此,AIS的临床药物治疗仍是一个很大的问题。BIT是近年来研究的热点,并且从临床现象也观察到了人脑中BIT的存在。脑缺血后的炎症反应是造成脑损伤的重要原因,作为中枢神经系统先天免疫系统的关键组成部分,TLRs在介导脑缺血后炎症损伤过程中起到了关键作用。本研究发现,IPC诱导的脑缺血耐受改变了TLR4信号轴相关炎性因子的表达模式,参与了BIT的产生,明显减轻了pMCAO后的炎症反应,减轻了脑缺血损伤的程度,因此,采用相应的制剂提前干预TLRs信号系统的某些作用环节,诱导TLRs信号轴重新编程,减轻脑缺血后的炎症损伤,是治疗急性脑梗死、改善预后的信策略,有望对急性脑梗死的治疗带来新的突破。LPS和CpG,TLRs的外源性配体HMGB1在动物实验中已经显示出了它们在急性脑梗死治疗的前景。