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单核细胞增多李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)被WHO列为4大食源性致病菌之一，是人畜共患李斯特菌病的主要病原菌，LM可穿越宿主血脑屏障引发人和动物的脑炎，病死率可达20-70％，但LM穿越血脑屏障的机制尚未阐明。在前期研究中，实验室从一只神经症状患病绵羊脑内分离得到一株LM，将其命名为LM90。本研究采用分裂泛素化酵母双杂交系统筛选LM90株Inlc、Ami等表面蛋白与人脑微血管内皮细胞相互作用的捕获蛋白，并利用免疫共沉淀方法验证酵母双杂交筛选到的捕获蛋白，揭示这些捕获蛋白在LM侵染人脑微血管内皮细胞过程中的作用机制，为进一步阐明LM穿越血脑屏障的分子机理以及筛选针LM的药物靶点提供科学依据。 1利用分裂泛素化酵母双杂交体系筛选捕获蛋白 为了筛选LM的毒力因子内化素蛋白家族(Internalin，Inl)、自溶素(Auto)、酰胺酶(Ami)与脑微血管内皮细胞相互作用的捕获蛋白，用已转化有pBT3-N-InlC、pDHB1-InlB、pDHB1-InlJ、pDHB1-Ami、pDHB1-Auto的酵母NMY51再转化人/鼠脑微血管内皮细胞的cDNA文库质粒，利用分裂泛素化酵母双杂交系统(splti-ubiquitinyeast two hybrid)，筛选在酵母NMY51中共表达并相互作用蛋白，对编码捕获蛋白的文库质粒进行纯化、鉴定，测序分析获得编码prey蛋白基因的序列。结果表明共筛选到与InlC相互作用的假定捕获蛋白基因6个，与Ami相互作用的假定捕获蛋白基因4个。本实验为利用免疫共沉淀方法验证LM的毒力因子与捕获蛋白之间的相互作用奠定基础。 2构建诱饵蛋白和假定捕获蛋白基因真核表达载体 为了构建诱饵蛋白和假定捕获蛋白基因真核表达载体及在HEK293细胞中的表达，采用RT-PCR、PCR方法，扩增诱饵蛋白和cDNA文库中假定捕获蛋白以及假定捕获蛋白CDS区基因，诱饵蛋白和假定捕获蛋白基因分别与真核表达载体pCMV、pACGFP连接。采用Lipofactamine2000转染HEK293细胞，荧光显微镜检测绿色荧光；判断GFP蛋白的表达情况。结果表明：成功构建真核表达载体16个，其中捕获蛋白基因真核表达载体为14个：H1-pACGFP、H6-pACGFP、H9-pACGFP、H11-pACGFP、H12-pACGFP、A7-pACGFP、A24-pACGFP、A45-pACGFP；CDSH6-pACGFP、CDSH7-pACGFP、CDSH9-pACGFP、CDSH11-pACGFP、CDSH12-pACGFP、CDSA7-pACGFP；诱饵蛋白表达载体为2个：Ami-pCMV-HA、InlC-pCMV-HA，转染HEK293细胞24 h后，捕获蛋白基因真核表达载体在荧光显微镜下可见绿色荧光，表明GFP蛋白表达，重组真核表达质粒成功转入HEK293，本研究为单增李斯特菌与脑微血管内皮细胞cDNA文库中相互作用蛋白的鉴定奠定了基础。 3免疫共沉淀验证假定捕获蛋白 为了验证LM的毒力因子Ami、InIc与假定捕获蛋白之间的相互作用，本试验利用免疫共沉淀、Western-blot方法对前期筛到的假定捕获蛋白进行进一步筛选验证。结果表明：CDSH9-pACGFP和InlC-pCMV-HA共转染的细胞提取物以及H9-pACGFP和InlC-pCMV-HA共转染的细胞提取物，WB染色后分别在101 KDa及78 KDa附近出现预计大小的相互作用条带，提示人脑微血管内皮细胞的ACTG1与LM的InIC毒力因子发生互作。 试验结果为分析毒力因子及捕获蛋白在LM粘附侵染脑血管内皮细胞，穿越血脑屏障过程中的功能奠定基础，为揭示LM穿越血脑屏障的分子机理和进行LM药物靶点的选择提供科学依据。