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目的
阴沟肠杆菌是人的正常肠道菌群，通常不致病。近年来，一些菌株可引起免疫缺陷或低下人群的泌尿道和呼吸道感染。本文通过分析温州地区临床分离的阴沟肠杆菌株携带的抗性基因、抗性基因的功能及其相关序列的结构，耐药性基因在不同种属菌株的分布，揭示耐药性基因水平转移的分子机制，本文研究结果对临床中合理使用抗菌药物、延长抗菌药物的使用寿命，具有一定的参考价值。
方法
1.基因组测序：用GENEray细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，通过新一代高通量测序平台（IlluminaHiSeq-2500和PacificBiosciencesequencers测序平台）测定阴沟肠杆菌Y546的全基因组序列。PacificBiosciencesequencers测序得到长约10-20kb的长测序读长，拼接后用IlluminaHiSeq-2500测序读长进行测序校正，最后得到高质量的全基因组序列。用Glimmer3.02software进行ORF预测，用BLASTx进行蛋白质数据库比对对ORF进行功能注释，用CGViewServer进行质粒圈图的绘制，用在线软件（如tRNAscan-SE2.0等）进行RNA基因的注释。
2.耐药性基因的筛选和耐药性基因的克隆：通过PCR扩增筛选β-内酰胺酶基因blaMIR阳性的阴沟肠杆菌株，通过分子克隆技术克隆包括blaMIR基因在内的3个β-内酰胺酶基因。用PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR。用相应的限制性内切核酸酶消化ORF的PCR产物，然后连接到用相同的限制性内切核酸酶处理的载体pET-28a中。使用氯化钙转化法将所得重组质粒转化到BL21中。分离重组质粒并用限制酶消化以确认插入片段的大小。通过测序进一步鉴定转化体的克隆片段，并使用BLASTn程序与参考抗性基因序列比较。
3.药物敏感性实验：利用琼脂稀释法测定耐药性基因及相关菌株的耐药性水平（最低抑菌浓度，MIC）。用0.9％盐水在对数生长期稀释细菌，得到0.5McFarland标准悬浮液，相当于5×105CFU/mL的接种物。将约5μL的悬浮液涂布在MH琼脂平板上。然后将接种的平板在37℃下在恒温培养箱中温育18小时。在最低的抗菌药物浓度下没有菌落生长时的抗菌药物浓度即为MIC值。
4.克隆相关性分析：用BioRad脉冲场凝胶电泳（PFGE）仪进行DNA指纹电泳，用Bio-RadQuantityOneprogram进行电泳结果分析，评估携带blaMIR的阴沟肠杆菌的克隆相关性；利用MLST分析blaMIR阳性菌株的ST型。
5.系统发生分析：利用ClustAl等程序分析blaMIR编码蛋白MIR氨基酸序列的多样性，进行MIR蛋白的系统发育分析。
6.比较基因组学分析：使用抗性基因序列作为查询序列，通过BLASTn程序从NCBI核苷酸数据库获得含有抗性基因的序列，过滤后保留含有完整抗性基因的序列，利用比较基因组分析方法，分析质粒pY546结构的演变及进化。
结果
1.在212株临床分离的阴沟肠杆菌中，共检出6株携带blaMIR的菌株。
2.6个来自不同菌株的blaMIR基因（pET28a-blaMIR/BL21）具有抗菌活性，对氨苄青霉素，头孢唑啉，头孢米诺和头孢西丁具有一定程度的抗性；Y546染色体上编码的超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因blaSHV-12和blaCTX-M-9a，对上述四种β-内酰胺抗菌药物显示出更高的水解活性。
3.blaMIR阳性阴沟肠杆菌菌株Y546（Y546）的基因组由长度为4.78Mb，编码4,312个开放阅读框（ORF）的染色体和一个大质粒（pY546，长度为208.74kb，编码234个ORFs）组成。基因组编码多个抗性基因；在染色体上编码了2个超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因（blaSHV-12和blaCTX-M-9a）和AmpC（blaMIR）基因，pY546质粒含有几个赋予金属抗性的基因簇。
4.blaMIR阳性菌株具有不同的PFGE模式，无克隆相关性。MLST(多位点序列标签)确定阴沟肠杆菌菌株Y546含有leuS-90，rpoB-20，gyrB-127，dnaA-120，fusA-25和rplB-12等位基因，属于ST466序列。
5.基因型分析结果显示，在本文的6个MIR基因中，CG85和Y482的blaMIRORFs属于blaMIR-17基因型，而菌株CG34，CG76，Y490和Y546的ORFs则分别属于blaMIR-5，blaMIR-21，blaMIR-3和blaMIR-20等基因型。这些MIR蛋白质与它们各自的参考序列具有99％或以上的氨基酸序列相似性。
6.系统发育分析显示，除了来自CG85和Y482的2个具有相同氨基酸序列并位于同一分支中的序列外，其余4个MIR蛋白分布于不同的分支中。
7.比较基因组学分析显示：与pY546具有最高相似性的序列来自肺炎克雷伯菌的质粒和大肠杆菌的染色体，并且具有最高相似性的序列片段pY546上的重金属抗性基因簇来自其他质粒和其他染色体序列。
结论
?携带blaMIR的阴沟肠杆菌株Y546的全基因组分析表明该菌株携带多种抗性基因，包括编码于染色体的耐药性基因和编码于质粒的重金属抗性基因簇，赋予细菌对抗菌药物和消毒剂等的抗性。对质粒序列和重金属抗性基因编码区进行的比较基因组分析表明，其他种属细菌如肺炎克雷伯菌的相关序列与pY546的序列具有较高的相似性，表明决定抗性的DNA元件可以在不同种属细菌之间进行水平转移，引起抗性的传播。在临床分离株中出现携带重金属抗性基因的质粒，表明细菌不但具有对临床抗菌药物的抗性，也具备了对常用消毒杀菌化学试剂的抗性，需引起临床和社会的高度重视。
阴沟肠杆菌是人的正常肠道菌群，通常不致病。近年来，一些菌株可引起免疫缺陷或低下人群的泌尿道和呼吸道感染。本文通过分析温州地区临床分离的阴沟肠杆菌株携带的抗性基因、抗性基因的功能及其相关序列的结构，耐药性基因在不同种属菌株的分布，揭示耐药性基因水平转移的分子机制，本文研究结果对临床中合理使用抗菌药物、延长抗菌药物的使用寿命，具有一定的参考价值。
方法
1.基因组测序：用GENEray细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，通过新一代高通量测序平台（IlluminaHiSeq-2500和PacificBiosciencesequencers测序平台）测定阴沟肠杆菌Y546的全基因组序列。PacificBiosciencesequencers测序得到长约10-20kb的长测序读长，拼接后用IlluminaHiSeq-2500测序读长进行测序校正，最后得到高质量的全基因组序列。用Glimmer3.02software进行ORF预测，用BLASTx进行蛋白质数据库比对对ORF进行功能注释，用CGViewServer进行质粒圈图的绘制，用在线软件（如tRNAscan-SE2.0等）进行RNA基因的注释。
2.耐药性基因的筛选和耐药性基因的克隆：通过PCR扩增筛选β-内酰胺酶基因blaMIR阳性的阴沟肠杆菌株，通过分子克隆技术克隆包括blaMIR基因在内的3个β-内酰胺酶基因。用PrimeSTARHSDNA聚合酶进行PCR。用相应的限制性内切核酸酶消化ORF的PCR产物，然后连接到用相同的限制性内切核酸酶处理的载体pET-28a中。使用氯化钙转化法将所得重组质粒转化到BL21中。分离重组质粒并用限制酶消化以确认插入片段的大小。通过测序进一步鉴定转化体的克隆片段，并使用BLASTn程序与参考抗性基因序列比较。
3.药物敏感性实验：利用琼脂稀释法测定耐药性基因及相关菌株的耐药性水平（最低抑菌浓度，MIC）。用0.9％盐水在对数生长期稀释细菌，得到0.5McFarland标准悬浮液，相当于5×105CFU/mL的接种物。将约5μL的悬浮液涂布在MH琼脂平板上。然后将接种的平板在37℃下在恒温培养箱中温育18小时。在最低的抗菌药物浓度下没有菌落生长时的抗菌药物浓度即为MIC值。
4.克隆相关性分析：用BioRad脉冲场凝胶电泳（PFGE）仪进行DNA指纹电泳，用Bio-RadQuantityOneprogram进行电泳结果分析，评估携带blaMIR的阴沟肠杆菌的克隆相关性；利用MLST分析blaMIR阳性菌株的ST型。
5.系统发生分析：利用ClustAl等程序分析blaMIR编码蛋白MIR氨基酸序列的多样性，进行MIR蛋白的系统发育分析。
6.比较基因组学分析：使用抗性基因序列作为查询序列，通过BLASTn程序从NCBI核苷酸数据库获得含有抗性基因的序列，过滤后保留含有完整抗性基因的序列，利用比较基因组分析方法，分析质粒pY546结构的演变及进化。
结果
1.在212株临床分离的阴沟肠杆菌中，共检出6株携带blaMIR的菌株。
2.6个来自不同菌株的blaMIR基因（pET28a-blaMIR/BL21）具有抗菌活性，对氨苄青霉素，头孢唑啉，头孢米诺和头孢西丁具有一定程度的抗性；Y546染色体上编码的超广谱β-内酰胺酶（ESBL）基因blaSHV-12和blaCTX-M-9a，对上述四种β-内酰胺抗菌药物显示出更高的水解活性。
3.blaMIR阳性阴沟肠杆菌菌株Y546（Y546）的基因组由长度为4.78Mb，编码4,312个开放阅读框（ORF）的染色体和一个大质粒（pY546，长度为208.74kb，编码234个ORFs）组成。基因组编码多个抗性基因；在染色体上编码了2个超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因（blaSHV-12和blaCTX-M-9a）和AmpC（blaMIR）基因，pY546质粒含有几个赋予金属抗性的基因簇。
4.blaMIR阳性菌株具有不同的PFGE模式，无克隆相关性。MLST(多位点序列标签)确定阴沟肠杆菌菌株Y546含有leuS-90，rpoB-20，gyrB-127，dnaA-120，fusA-25和rplB-12等位基因，属于ST466序列。
5.基因型分析结果显示，在本文的6个MIR基因中，CG85和Y482的blaMIRORFs属于blaMIR-17基因型，而菌株CG34，CG76，Y490和Y546的ORFs则分别属于blaMIR-5，blaMIR-21，blaMIR-3和blaMIR-20等基因型。这些MIR蛋白质与它们各自的参考序列具有99％或以上的氨基酸序列相似性。
6.系统发育分析显示，除了来自CG85和Y482的2个具有相同氨基酸序列并位于同一分支中的序列外，其余4个MIR蛋白分布于不同的分支中。
7.比较基因组学分析显示：与pY546具有最高相似性的序列来自肺炎克雷伯菌的质粒和大肠杆菌的染色体，并且具有最高相似性的序列片段pY546上的重金属抗性基因簇来自其他质粒和其他染色体序列。
结论
?携带blaMIR的阴沟肠杆菌株Y546的全基因组分析表明该菌株携带多种抗性基因，包括编码于染色体的耐药性基因和编码于质粒的重金属抗性基因簇，赋予细菌对抗菌药物和消毒剂等的抗性。对质粒序列和重金属抗性基因编码区进行的比较基因组分析表明，其他种属细菌如肺炎克雷伯菌的相关序列与pY546的序列具有较高的相似性，表明决定抗性的DNA元件可以在不同种属细菌之间进行水平转移，引起抗性的传播。在临床分离株中出现携带重金属抗性基因的质粒，表明细菌不但具有对临床抗菌药物的抗性，也具备了对常用消毒杀菌化学试剂的抗性，需引起临床和社会的高度重视。