基于适配体以及核酸自组装结构的ATP检测方法研究

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ATP作为一种高能磷酸化合物广泛存在于各种生物体内,参与各项重要的生理生化活动。实现对于ATP的检测将会对我们研究各项生命活动提供极大的帮助。目前针对ATP的检测方法已经开展了很多研究,对于检测传感器的灵敏度,检测的速度等各方面也提出了越来越高的要求。本论文基于核酸自组装结构,构建了利用电化学以及适配体进行ATP高灵敏快速检测的生物传感器。本实验是利用当ATP存在时,四面体结构会对其产生响应从而发生构型变化形成G-四链体,通过电化学平台将这种变化转化为电信号实现对ATP的高灵敏检测。首先利用四条经过设计的序列进行四面体结构的合成,其中两条序列一条设计有ATP适配体,另一条设计有用于信号产生的G-四链体的两部分序列。然后将电极与靶标分子ATP以及血红素在一起孵育反应。当ATP存在时,一方面适配体与ATP结合从而使适配体发生形变,从而缩短四面体两个端点的距离。另一方面设计有G-四链体部分序列的两端由于距离缩小从而形成G-四链体,由于血红素进入形成复合物从而引起电极表面的电阻发生变化。通过差分脉冲伏安法(DPV)可以观察到有明显的信号变化。而当靶标ATP不存在时,由于G-四链体的两部分序列距离较远而不会形成结构,所以无法产生信号变化。为了得到最佳的检测效果,首先对序列碱基进行了优化。然后通过对序列浓度,血红素浓度,MCH的封闭时间以及加入靶标和血红素后的孵育时间这些实验关键条件的优化,在最优条件下进行ATP的检测,发现DPV中的峰电流值与ATP的浓度在0.7-70 nmol?L-1范围内线性相关,通过拟合得到线性方程,然后计算出ATP的检测限为50 pmol?L-1。通过与ATP的类似物进行特异性实验表明该传感器对ATP具有很好的特异性。最后将构建好的传感器用于实际样品的检测,分别选取人体血清以及实际水样进行了检测,都得到了比较好的检测效果。这就表明构建的生物传感器在医疗检测和环境监控上有很好的应用前景。
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