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黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AS-IV),是中药材黄芪的重要有效化学成分之一。AS-IV属于环黄芪醇为苷元的皂苷类,具有多种药理作用。研究证实其保护心血管系统作用包括:增强免疫功能,抗炎,抗病毒,抗氧化,减轻缺血缺氧心肌的损伤,增强心肌收缩力,舒张血管,以及扩冠状动脉等作用。
AS-IV用于心血管疾病治疗,但其作用机制尚未明确,尤其对心电生理的影响尚无报道。本论文的第一部分,采用急性分离的豚鼠心室肌细胞,应用膜片钳技术观察AS-IV对心肌细胞动作电位和细胞膜各种离子通道电流的影响。第二、三部分,应用膜片钳技术和内钙测定技术分别考察AS-IV对钙信号通路的影响。第四部分,采用膜片钳技术探讨AS-IV对L型钙通道的调节机制。
方法:
一、单个豚鼠心室肌细胞的制备
利用Langendorff灌流装置,采用胶原酶消化豚鼠心室肌细胞,得到单个心肌细胞。
二、心肌细胞动作电位的检测
采用膜片钳技术,在电流钳模式下,检测豚鼠心室肌细胞的动作电位,观察AS-IV对细胞静息电位(resting membrane potential,RMP),动作电位幅度(actionpotential amplitude,APA),以及动作电位时程(action potential duration,APD)的影响。
三、心肌细胞膜离子通道电流的检测
采用膜片钳技术,在电压钳模式下,应用不同细胞内外液,并给予相应的电压刺激,诱导豚鼠心室肌细胞膜不同离子通道电流,观察AS-IV对膜钠、钾、钙通道的电流大小和电流-电压(current-voltage,I-V)曲线的影响。
四、豚鼠心室肌细胞内钙测定
应用新鲜分离得到单个豚鼠心室肌细胞,采用Fluo-3/AM钙指示剂孵育标记细胞内钙,利用荧光显微镜测定,观察AS-IV对细胞内钙的影响。
五、H9c2细胞内钙测定
在共聚焦专用小皿培养H9c2细胞,采用Fluo-3/AM钙指示剂孵育标记细胞内钙,利用激光共聚焦扫描成像系统测定,观察AS-IV对细胞内钙的影响。
六、单通道钙电流的检测
应用膜片钳单通道技术,分别采用细胞贴附模式和膜内向外模式,观察AS-IV对单通道钙电流的影响。
结果:
一、AS-IV对心肌细胞动作电位的影响
低、中、高三个浓度AS-IV均显著延长APD。其中,中浓度AS-IV(1×10-6M)作用最明显(APD25:111.5±18.9 in10-6 M v.s.13.1±4.1 in Control,P<0.01;APD50:574.3±77.4 in10-6M v.s.189.2±40.3 in Control,P<0.001;APD95:785.3±83.7 in10-6 M v.s.313.1±38.9 in Control,P<0.001)。但是,低、中、高三个浓度AS-IV对心肌细胞RMP和APA均无显著影响。
二、AS-IV对心肌细胞膜离子通道电流的影响
低、中、高三个浓度AS-IV对心肌细胞的钠电流(sodium currents,INa)和I-V曲线都没有改变,提示钠通道可能不是AS-IV的作用靶点。
低、中、高三个浓度AS-IV对心肌细胞内向整流钾电流(inward rectifierpotassium currents,IK1)电流几乎无影响,仅在远离平衡电位(-130~110 mV)时,AS-IV使IK1电流略微增加。而对延迟外向整流钾电流(delayed outward rectifierpotassium currents,IK),低、中、高三个浓度AS-IV有不同程度的抑制作用,并且中浓度AS-IV(1×10-6M)作用最为显著。对照组IK尾电流(IK tail)在电压为0、+10、+20、+30、+40 mV时分别为1.17±0.12,1.54±0.12,1.93±0.13,2.22±0.13,2.46±0.13 pA/pF,而1×10-6 M AS-IV组其值分别降低至0.85±0.04,1.14±0.05,1.43±0.04,1.65±0.04,1.78±0.05 pA/pF(P<0.05,P<0.01)。
低、中、高三个浓度AS-IV均使钙电流I-V曲线上移,即所有测试电压条件下的L型钙电流(L-type calcium currents,ICaL)都减小。0mV去极化刺激诱导心肌细胞ICaL,低、中、高三个浓度AS-IV分别降低ICaL至对照组的61.2%±7.2%(P<0.05),52.8%±6.3%(P<0.01),60.9%±5.8%(P<0.05)。其中1×10-6 M AS-IV抑制作用最强。
三、AS-IV对心肌细胞纯钙电流的影响
应用膜片钳全细胞记录心肌细胞纯钙电流。低、中、高浓度AS-IV都明显抑制ICaL,而中浓度AS-IV作用最强(-2.25±0.41 pA/pF in10-6M v.s.-4.66±0.61pA/pF in Control,P<0.01)。
当细胞外液中加入钙泵抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)时,AS-IV对纯钙电流的抑制作用呈剂量依赖性(-2.73±0.23 pA/pF in10-7 M,-2.25±0.12pA/pF in10-6 M,-1.78±0.28 pA/pF in10-5 M v.s.-4.42±0.58 pA/pF in Control)。与无TG实验相比,此时细胞内钙耗竭,结果显示高浓度AS-IV(1×10-5 M)抑制作用最强。
四、AS-IV对心肌细胞内钙浓度的影响
首先观察AS-IV急性分离的豚鼠心室肌细胞内钙变化。在细胞外液无钙状态下,1×10-6M AS-IV可引起细胞内钙浓度的显著增加,给药后荧光值与基础荧光值的比值(F/F0)由对照组的0.08±0.02增加到0.23±0.07(P<0.05)。
其次,利用激光共聚焦检测H9c2细胞内钙浓度,观察低、中、高三个浓度AS-IV对细胞内钙浓度的影响。结果发现AS-IV增加内钙浓度呈剂量依赖性,高浓度1×10-5 M作用最强(1.27±0.04 in10-7 M,1.44±0.03 in10-6M,1.60±0.04in10-5 M v.s.1.04±0.01 in Control,P<0.001)。
五、AS-IV对心肌细胞L型钙通道单通道电流的影响
应用单通道膜片钳技术,先在细胞贴附模式下,观察AS-IV对心肌细胞L型钙通道活性(NPo)的影响。结果显示低、中、高三个浓度AS-IV都使NPo显著降低(0.15±0.03 in10-7 M,0.08±0.02 in10-6 M,0.13±0.04 in10-5 M v.s.0.37±0.10 in Control,P<0.05),其中1×10-6M AS-IV抑制作用最为显著。
而在膜内向外模式下,发现AS-IV对钙通道活性的抑制作用则呈剂量依赖性。对照组的相对钙通道活性为147.9%±30.4%,低、中、高三个浓度AS-IV抑制相对钙通道活性至101.5%±18.7%,67.3%±9.2%(P<0.01),28.6%±5.9%(P<0.001)。与细胞贴附模式相比,该模式记录时消除了胞浆内其它因子的影响,结果显示高浓度AS-IV(1×10-5M)抑制作用最强。
六、AS-IV影响钙通道的失活机制
应用膜片钳技术,选用1×10-6 M AS-IV,研究其影响心肌细胞膜L型钙通道的机制。实验表明,AS-IV对钙通道的激活曲线没有影响,但使钙通道的失活曲线左移。其中失活曲线的V1/2由对照组的-25.6±0.9 mV降至-31.0±2.2 mV(P<0.05),k值由3.6±0.2增至5.4±0.7(P<0.05)。结果提示,AS-IV参与了钙通道电压依赖性的失活(voltage-dependent inacitvation,VDI),使得通道在较低电压较快失活。
本课题基础电极内液的Ca2+螯合剂为ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA)。这里探讨AS-IV是否参与钙依赖性的失活(Ca2+-dependent inacitvation,CDI),用另一种更强且快速的Ca2+螯合剂1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N,N-tetraacetic acid(BAPTA)取代EGTA。因为BAPTA能快速螯合胞浆内钙,使内钙浓度处于一个低水平的稳态,所以高浓度Ca2+条件下产生的CDI就消失了。我们实验证实采用含BAPTA的电极内液时,未给予AS-IV药物处理组,ICaL的失活过程减慢。其中失活的快时间常数(fast time constant,τfast)从10.4±1.1 ms延长到17.2±2.4 ms(P<0.01);失活的慢时间常数(slow timeconstant,τ slow)从122.7±9.8 ms延长到177.0±18.1 ms(P<0.01)。而给予AS-IV处理后,BAPTA组和EGTA组之间区别消失,快、慢时间常数都没有显著变化。结果提示,AS-IV参与了心肌细胞钙通道的CDI调节机制。
七、AS-IV影响钙通道的开关动力学
首先,在细胞贴附模式下,AS-IV减小开放时间常数(open time constant,τo)至对照组的一半以下。其中快成分τo,fast由2.15±0.35 ms降至0.82±0.14 ms(P<0.01);慢成分τ o,slow由10.24±0.96 ms降至4.92±1.64 ms(P<0.05)。同样给予AS-IV处理,钙通道关闭时间常数(close time constant,τc)的两成分则均显著延长。其中τc,fast延长至3.75±1.17 ms(P<0.05),为原来的8.2倍;τc,slow延长至25.27±4.27 ms(P<0.05),是对照组的2倍。
在膜内向外模式下,AS-IV显著减小τ o。其中τo,fast由1.63±0.23 ms降至0.89±0.10 ms(P<0.05);τo,slow由15.70±1.76 ms降低到6.95±1.17 ms(P<0.01)。但采用这种游离膜片消除了胞浆内其它因子的影响时,钙通道τc并未见显著延长。
结论:
1、AS-IV影响心肌细胞电生理特性,包括延长APD,抑制IK和IcaL。但对INa几乎无影响。
2、AS-IV对心肌细胞膜钙电流有直接抑制作用。
3、AS-IV增加心肌细胞内钙浓度,间接地调节细胞膜L型钙离子通道。
4、AS-IV对心肌细胞膜L型钙通道的影响主要通过通道失活机制发挥作用,既影响了通道的VDI,同时也有CDI的参与。
5、在钙通道的开关动力学方面,AS-IV缩短了单个钙通道的开放时间,并且对通道关闭时间也有一定影响。
本研究结果将为AS-IV在心血管疾病治疗中的应用提供重要的理论依据。