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立论依据： 大面积深度烧伤创面的覆盖是烧伤医学面临的难题之一。一方面，大面积烧伤患者的自体皮或培养的自体表皮的来源不足，另一方面，采用异体皮或异种皮时的排斥反应还无法克服。因此，大面积深度烧伤患者的创面覆盖仍然是一个需要解决的大问题。而表皮来源于表皮基底层的干细胞，由于分离表皮干细胞的技术难度较大，国内尚无这方面的报道。因此，若能分离出表皮干细胞并加以诱导、调控，为进一步构建组织工程皮肤提供具有无限增殖能力的种子细胞，并在体外预先构建出结构类似的皮肤，无疑会为深度烧伤创面覆盖带来一场技术革命。 实验目的： 1．建立一种分离、鉴定和培养基底细胞的方法； 2．采用流式细胞分选技术并结合表皮干细胞的粘附特性分离出表皮干细胞； 3．为下一步调控表皮干细胞的生长、分化以及构建组织工程皮肤提供种子细胞奠定基础。 材料和方法： （1）基底细胞的分离和鉴定：首先用中性蛋白酶和胰酶从人包皮分离基底细胞；再以鼠抗人K14的单克隆IgG抗体为一抗，采用免疫细胞化学S-P法来鉴定这些基底细胞。 （2）基底细胞内表皮干细胞的鉴定：以鼠抗人K19单克隆IgG抗体为一抗，采用免疫细胞化学S-P法来鉴定基底细胞内的干细胞。 （3）基底细胞培养：基底细胞被接种到3T3细胞为滋养层的培养瓶内，37℃、5％CO2孵箱中培养，DMEM培养液中添加10-15％胎牛血清和Zon创ml表皮生长因子、10n岁ml霍乱毒素和0.4 g/ml氢化考的松。一周许，用EDI人移去滋养层细胞，继续培养3一5天可传代。 （4）表皮干细胞的分离:以鼠抗人a6p;整合素（CD49f）的单克隆IgG抗体（一抗）及结合异硫氰酸酷荧光素（FITC）的羊抗鼠IgG抗体（二抗）标记基底细胞，通过流式细胞仪先分选出表皮干细胞和暂时放大细胞（暂时扩增细胞）细胞群;再根据表皮千细胞的粘附特性，借助人胎盘IV型胶原的粘附来分离出表皮干细胞。 （5）表皮干细胞的鉴定:采用鼠抗人K19的单克隆IgG抗体为一抗，通过S一P法来鉴定表皮干细胞。 结果: （l）用中性蛋白酶和胰酶依次消化可分离出表皮基底细胞，且这些基底细胞的活性良好。免疫细胞化学染色显示:基底细胞大多数呈圆形，大小不一，几乎全被染成棕黄色，胞浆着色深，核大，位于中央。 （2）基底细胞内的干细胞数目少，被染成棕黄色，而其他基底细胞不着色。 （3）用含胎牛血清和表皮生长因子、霍乱毒素的DMEM培养液来培养基底细胞，1周许，用EDTA移去滋养层细胞，继续培养3一5天角阮细胞可传代。 （4）标记异硫氰酸醋荧光素（FITC）后的基底细胞，通过流式细胞术将基底细胞中的表皮干细胞（KSC）和暂时放大细胞（TAC）亚群与定向后细胞分开，KSC和TAC悬液在用100 p g/ml的Iv型胶原粘附时，表皮干细胞的粘附在20min内即完成，而暂时放大细胞的粘附需60min以上。ZOmin内，将未粘附的细胞用PBS洗去，即获得分选出的表皮干细胞。 （5）采用表皮干细胞的特异抗体进行细胞免疫化学染色，结果显示:细胞大小一致，几乎全被染成棕黄色，呈外围深中央浅的环状，中央部分占的比例大。 结论: 本实验用中性蛋白酶和胰酶依次消化包皮所分离的细胞是表皮基底细 .Vll.胞。基底细胞中有少量的表皮干细胞。基底细胞被FITC标记后，在流式细胞仪上显示有荧光强度不同的细胞群，表皮干细胞和暂时放大细胞表达的Q6日4整合素（CD49f）无明显差异，而定向细胞表达的Q 6 p4水平较低。根据荧光强度的差异，由流式细胞仪首先可将表皮干细胞和暂时放大细胞与定向细胞分离开。表皮干细胞对IV型胶原的粘附作用比暂时放大细胞强，在涂有10opg/ml的rV型胶原的培养板内，表皮干细胞在 20min内即可粘附，而暂时放大细胞粘附需60min以上。免疫细胞化学S一P法证实分离出的细胞是人的表皮干细胞。 本研究的结果为进一步研究表皮干细胞生长、分化的调控以及组织工程皮肤的构建奠定基础。