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研究背景卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,早期无明显症状,大部分患者确诊时肿瘤已经发生了转移,患者五年生存率不足30%。卵巢癌由一系列具有不同起源、组织病理学特征、临床表现以及分子特征的肿瘤组成。目前卵巢癌患者的管理正在从“一刀切”向分子驱动的、组织学亚型特异性的管理策略转变。因此,需要进一步的研究来确定卵巢癌患者预后及肿瘤转移相关分子信号网络的复杂性。对原发性卵巢癌转移潜能研究的深入能够促进卵巢癌患者个体化治疗和整体管理策略的优化。卵巢癌中存在着广泛的表观遗传学改变。组蛋白去乙酰化酶9（Histone deacetylase 9,HDAC9）是IIa类组蛋白去乙酰化酶,它可以通过去乙酰化组蛋白及其非组蛋白底物参与调控细胞周期、免疫反应、血管生成和细胞凋亡等多种生物学过程。HDAC 9在多种肿瘤中作为癌基因发挥作用。在三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌中,异常表达的HDAC9能够增强肿瘤细胞的迁移能力且与患者较差的预后相关。目前,HDAC9在卵巢癌中的作用还不明确。本研究中,基于100例卵巢癌患者肿瘤样本分析发现,HDAC9对卵巢癌患者预后的影响具有组织学亚型特异性。在高级别浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与患者预后呈负相关。而在非浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与患者预后呈正相关。提示HDAC9可能成为判断不同组织学亚型卵巢癌患者预后的生物标志物。叉头框蛋白O1（Forkhead box O1,FOXO1）在恶性肿瘤发生发展过程中具有复杂的多重作用,是肿瘤研究关注的焦点。与正常组织相比,上皮性卵巢癌中FOXO1的表达水平明显增加且FOXO1的过度表达与患者预后不良相关,但分子机制尚不明确。多项研究表明FOXO1能够与转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGFβ）启动子结合并促进TGFβ的表达,参与调控肿瘤转移和化疗耐药,提示FOXO1可能通过调控TGFβ的表达促进卵巢癌恶性进展。Wnt/β-catenin信号通路是经典的肿瘤转移相关通路。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的核心转录因子,进入细胞核后,β-catenin通过募集转录因子和共激活因子调控下游基因的表达。乙酰化通过影响FOXO1和β-catenin蛋白的亚细胞定位调控其转录活性及下游基因的表达。但在卵巢癌中,HDAC9对FOXO1和β-catenin的调控作用还不明确。通过探讨HDAC9对卵巢癌细胞中FOXO1和β-catenin蛋白亚细胞定位和转录活性的调控作用,可能有助于阐明HDAC9影响卵巢癌患者预后的机制。本研究以表观遗传修饰为切入点,基于临床患者标本、卵巢癌组织c DNA微阵列数据和人卵巢癌细胞系SKOV3和A2780,观察HDAC9对卵巢癌细胞中FOXO1和β-catenin蛋白亚细胞定位及转录活性的影响,探讨HDAC9对卵巢癌细胞侵袭迁移能力的调控机制,以期为卵巢癌患者的临床治疗提供新策略。研究方法1、通过免疫组织化学染色法检测100例卵巢癌患者肿瘤组织中HDAC9的表达情况。分析HDAC9蛋白表达水平与卵巢癌患者总生存期、复发风险及肿瘤转移之间的相关性。2、构建HDAC9敲减载体（sh HDAC9-1,2,3）和过表达载体（pc DNA3.1-HDAC9）,转染到A2780细胞（子宫内膜样卵巢癌细胞系）及SKOV3细胞（浆液性卵巢癌细胞系）后,Western blot检测卵巢癌细胞中HDAC9蛋白水平,q RT-PCR检测卵巢癌细胞中HDAC9转录水平。3、检测HDAC9对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。向A2780及SKOV3细胞中转染sh HDAC9-1,2和pc DNA3.1-HDAC9后,克隆形成实验检测A2780及SKOV3细胞增殖能力;Annexin V/PI双染法检测A2780及SKOV3细胞凋亡水平。4、检测HDAC9对卵巢癌细胞迁移能力的影响。向A2780及SKOV3细胞中转染sh HDAC9-1,2和pc DNA3.1-HDAC9后,细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;Western blot检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin、MMP2及MMP9的蛋白水平。5、从GEO数据库获取卵巢癌组织c DNA微阵列数据,筛选HDAC9高表达患者与HDAC9低表达患者之间的差异表达基因,并对差异表达基因进行KEGG富集分析。6、检测HDAC9对卵巢癌细胞中FOXO1蛋白亚细胞定位的影响。向A2780及SKOV3细胞中转染sh HDAC9-1,2和pc DNA3.1-HDAC9后,Western blot检测细胞中FOXO1蛋白水平;免疫荧光检测细胞中FOXO1蛋白的亚细胞定位;Western blot检测细胞核蛋白和胞浆蛋白中FOXO1的蛋白水平。7、从GEO数据库获取卵巢癌组织c DNA微阵列数据,筛选FOXO1高表达患者与FOXO1低表达患者之间的差异表达基因,并对差异表达基因进行KEGG富集分析。8、检测HDAC9对卵巢癌细胞TGFβ信号通路的调控作用。向A2780及SKOV3细胞中转染sh HDAC9-1,2和pc DNA3.1-HDAC9后,Western blot检测细胞中TGFβ、SMAD2/3及P-SMAD2/3蛋白水平的变化;Western blot检测细胞中EMT相关转录因子snail和slug的蛋白水平。9、检测HDAC9对卵巢癌细胞中β-catenin蛋白亚细胞定位的影响。向A2780及SKOV3细胞中转染sh HDAC9-1,2和pc DNA3.1-HDAC9后,Western blot检测细胞中β-catenin蛋白水平;免疫荧光实验检测细胞中β-catenin蛋白的亚细胞定位;Western blot检测细胞中β-catenin蛋白赖氨酸49位点乙酰化水平的变化。结果1、根据卵巢癌组织学亚型将患者分为高级别浆液性卵巢癌患者组和非浆液性卵巢癌患者组。Kaplan-Meier生存分析结果表明,在高级别浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与患者预后呈负相关。而在非浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与患者预后呈正相关。2、在高级别浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与复发风险呈正相关。而在非浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与复发风险呈负相关。3、非浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与肿瘤转移呈负相关。4、Western blot及q RT-PCR结果表明,HDAC9敲减及过表达载体均具有很高的转染效率。后续实验中本研究选取sh HDAC9-1,2进行HDAC9的敲减。5、克隆形成实验及Annexin V/PI双染法结果表明改变HDAC9水平对A2780细胞及SKOV3细胞增殖能力和凋亡水平没有明显影响。6、与对照组相比,过表达HDAC9后,SKOV3细胞侵袭和迁移能力增强,细胞中E-cadherin表达降低,N-cadherin、vimentin、MMP2及MMP9表达增高。敲减HDAC9后,SKOV3细胞侵袭和迁移能力减弱,细胞中E-cadherin表达增加,N-cadherin、vimentin、MMP2及MMP9表达降低。7、与对照组相比,过表达HDAC9后,A2780细胞侵袭和迁移能力减弱,细胞中E-cadherin表达增高,N-cadherin、vimentin、MMP2及MMP9表达降低。敲减HDAC9后,A2780细胞侵袭和迁移能力增强,细胞中E-cadherin表达降低,N-cadherin、vimentin、MMP2及MMP9表达增高。8、KEGG富集分析结果表明,浆液性卵巢癌中,HDAC9高表达患者与HDAC9低表达患者之间的差异表达基因能够富集于FOXO信号通路。在非浆液性卵巢癌中,HDAC9高表达患者与HDAC9低表达患者之间的差异表达基因能够富集于Wnt信号通路,FOXO信号通路没有被显著富集。9、改变HDAC9水平对A2780及SKOV3细胞中FOXO1蛋白水平没有明显影响。免疫荧光结果表明,与对照组相比,过表达HDAC9能够促进SKOV3细胞中FOXO1蛋白的核积累;敲减HDAC9后,SKOV3细胞中FOXO1蛋白的胞浆定位增多。在A2780细胞中,改变HDAC9水平对细胞中FOXO1蛋白的亚细胞定位没有明显影响。10、KEGG富集分析结果表明,浆液性卵巢癌中,FOXO1高表达患者与FOXO1低表达患者之间的差异表达基因能够富集于TGFβ信号通路。在非浆液性卵巢癌中,FOXO1高表达患者与FOXO1低表达患者之间的差异表达基因没有富集于TGFβ信号通路。11、与对照组相比,过表达HDAC9后,SKOV3细胞中TGFβ蛋白水平和SMAD2/3蛋白磷酸化水平增高,snail和slug的表达增加。敲减HDAC9后,SKOV3细胞中TGFβ、P-SMAD2/3、snail和slug蛋白水平降低。12、改变HDAC9水平对A2780细胞中TGFβ蛋白水平和SMAD2/3蛋白磷酸化水平没有明显影响。与对照组相比,过表达HDAC9后,A2780细胞中snail和slug表达降低。敲减HDAC9后,A2780细胞中snail和slug表达增高。13、与对照组相比,过表达HDAC9后,A2780细胞中β-catenin蛋白赖氨酸49位点乙酰化水平和β-catenin蛋白的核定位降低。敲减HDAC9后,A2780细胞中β-catenin蛋白赖氨酸49位点乙酰化水平和β-catenin蛋白核积累增高。14、与对照组相比,过表达HDAC9后,SKOV3细胞中β-catenin蛋白赖氨酸49位点乙酰化水平降低。敲减HDAC9后,SKOV3细胞中β-catenin蛋白赖氨酸49位点乙酰化水平增高。改变HDAC9水平对SKOV3细胞中β-catenin蛋白的亚细胞定位没有明显影响。结论1、在高级别浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与患者预后呈负相关。在非浆液性卵巢癌患者中,HDAC9表达水平与患者预后呈正相关。HDAC9可能成为卵巢癌患者个体化治疗和判断不同组织学亚型卵巢癌患者预后的潜在靶点。2、在浆液性卵巢癌SKOV3细胞中,HDAC9通过促进FOXO1蛋白核积累上调TGFβ信号,进而激活细胞EMT过程并增强细胞侵袭迁移能力。在非浆液性卵巢癌A2780细胞中,HDAC9能够抑制β-catenin蛋白赖氨酸49位点乙酰化水平并促进β-catenin向胞浆转移,进而导致细胞EMT过程的抑制和细胞侵袭迁移能力的下降。