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目的:肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国死亡率第三的恶性肿瘤,术后的5年生存率仅有50%-70%。目前,肝癌的临床治疗存在预后差、易复发、病人生存率低等问题。新近的研究发现,Hippo/YAP通路的过度激活与肝癌关系密切,但Hippo/YAP(Yes-Associated Protein)通路在肝癌中过度激活的分子机制尚没有完全阐明。我们拟研究肌细胞增强因子MEF2D(Myocyte Enhancer Factor 2D)在Hippo/YAP通路活性调节中的作用,该研究将有助于人们对Hippo/YAP通路调控机制的理解,为肝癌的分子治疗提供新的靶点,不仅具有一定的科学意义,也具有相当的临床治疗价值。方法:首先,我们通过染色质免疫共沉淀实验验证MEF2D与AMOTL2(Angiomotin Like 2)启动子的结合;随后通过双荧光素酶报告实验来验证MEF2D是否通过结合AMOTL2启动子上游区域中MEF2顺式作用元件来抑制AMOTL2基因的转录表达;在肝癌细胞株Huh7,HepG2,PLC/RPF/5中过表达和沉默MEF2D后通过Western blotting检测AMOTL2蛋白的表达量变化,同时在肝癌细胞株PLC/RPF/5中过表达MEF2D后,通过定量PCR检测AMOTL2的mRNA的变化;为了证明MEF2D激活Hippo/YAP通路并促进肝癌细胞的增殖,在肝癌细胞株Huh7,HepG2,PLC/RPF/5中过表达MEF2D,通过Western blotting检测总YAP和磷酸化YAP的蛋白表达情况;使用CCK8法检测过表达MEF2D的Huh7细胞株在24小时,48小时和72小时,以及沉默MEF2D的细胞在24小时的OD值;为了验证MEF2D是通过AMOTL2的转录负调控实现了对Hippo/YAP通路活性的影响。我们设置Lv-shMEF2D组,Lv-shAMOTL2组,Lv-shMEF2D+Lv-shAMOTL2组和Control组。所有实验组在0小时和24小时经CCK8处理后记录450nm的OD值。结果:染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告实验结果表明,MEF2D可以结合AMOTL2启动子上游的MEF2顺式作用元件;Western blotting和定量PCR结果显示,AMOTL2的蛋白表达和mRNA在MEF2D过表达的细胞株中表达都下降;在沉默MEF2D的细胞中,AMOTL2的蛋白表达上升说明在实验用的肝癌细胞中MEF2D能抑制AMOTL2的表达。过表达MEF2D的细胞株中,YAP蛋白的表达量均上升,在Huh7中磷酸化YAP蛋白表达减少,而在细胞株HepG2,PLC/RPF/5中磷酸化YAP蛋白表达上升,YAP蛋白的相对磷酸化比率均减少,即MEF2D能促进YAP的表达。MEF2D过表达的Huh7细胞在24小时,48小时,72小时的OD值对比对照组明显上升(P<0.05);MEF2D沉默的Huh7细胞在24小时的OD值对比NC组明显下降(P<0.05),即MEF2D能促进细胞增殖。Lv-shMEF2D组和Lv-shMEF2D+Lv-shAMOTL2组在24小时的OD值对比Control组明显下降(P<0.05),并且细胞活力也明显下降(P<0.05);然而Lv-shMEF2D+Lv-shAMOTL2组对比Lv-shMEF2D组在24小时的OD值对比对照组明显上升(P<0.05),并且细胞活力明显上升(P<0.05),即MEF2D能够通过抑制AMOTL2的表达来促进细胞增殖。结论:本课题验证了MEF2D通过结合AMOTL2启动子上游区域的MEF2顺式作用元件抑制其转录表达,从而激活了Hippo/YAP通路在肝癌中的活性,进而促进了肝癌细胞的快速增殖。