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猪流行性腹泻是当前我国比较流行的猪病之一,它是一种猪群肠道性传染病,临床上可造成各个日龄猪群的呕吐,腹泻,脱水等症状,尤其7日龄哺乳仔猪发病死亡率较高。近几年,世界范围内大多区域均爆发变异PEDV,给全球养猪业造成重大打击。因此,研究该病的流行与变异情况,建立快捷简便的检测方法,摸索病毒繁殖条件,分离病毒显得尤为重要。本实验研究主要针对近两年我国华南四省PEDV的流行情况做PEDV流行病学调查及S基因全基因的遗传变异分析,并建立了PEDV经典毒株与流行毒株快速检测鉴别方法,分离鉴定了PEDV SC-14株,主要研究内容如下:1、PEDV的流行病学调查及S基因的遗传变异分析2014年2016年三年间,在我国华南地区（广东、广西、福建、江西）四个省份共采集300份的腹泻样品进行相关检测,检测结果发现江西地区阳性率最高达74%,广西地区阳性率最低为45%,四省的PEDV平均阳性率为58%。随机选取其中9份PEDV阳性病料进行PEDV S基因全基因测序,结果基因分析显示:9株均为PEDV流行毒株,这9株流行毒株S基因全基因同源性在98.5%99.6%,与疫苗毒株相比存在共同的2个区域插入和1个区域缺失片段,且独立于疫苗毒株,形成单独的进化树分支G2组。2、鉴别PEDV经典毒株与变异毒株的巢式RT-PCR方法的建立通过PEDV S基因分析可知当前PEDV流行变异毒株在S基因的58-62 aa处有4个氨基酸的插入（即12个碱基的插入）,依照这一特点本研究设计了两对特异性内外围扩增引物,经过优化扩增条件,特异性和敏感性系列试验,建立了一套可以快速鉴别PEDV变异毒株与经典毒株的巢式RT-PCR检测法,该检测方法可以快速鉴别PEDV变异毒株和经典毒株,经典毒株仅在外围扩增产物有719bp的条带,内围扩增产物没有条带;变异毒株在外围扩增产物有730 bp的条带,内围扩增产物有514 bp的条带。实验结果证明该巢式RT-PCR检测方法操作快捷简易、特异性和灵敏度均相对较好,是一种比较高效准确的实验室检测方法。3、PEDV SC-14株的分离、鉴定将检测为PEDV阳性的病料经过滤后在Vero细胞上连续进行盲传,当传至第8代时出现细胞皱缩,变圆等比较典型细胞病变,当在细胞中传至20代时病毒能够稳定增殖,且出现CPE的时间明显缩短。从31代开始,通过在培养体系中设置不同的胰酶终浓度、病毒的吸附时间以及病毒受体PAPN终浓度,将分离的病毒继续繁殖10代,后分别测定不同培养方式下病毒的TCID50值,结果发现当胰酶终浓度为15μg/mL,病毒的吸附时间达1.5 h,添加的病毒受体PAPN浓度5μg/mL时,PEDV SC-14株的病毒滴度最高为105.23/0.1m L,进一步优化了SC-14株的繁殖条件。并做了PEDV SC-14株全基因序列测序和分析,对SC-14株的全基因序列与疫苗株CV777进行比对分析,SC-14株属G1b组,统计有5个区域的基因缺失,分别在S基因上的455-457位上缺失3个碱基,ORF1a基因上的88-91位上缺失4个碱基,3398-3421位上缺失24个碱基,ORF1b基因上12501-12521位上缺失21个碱基,ORF3基因上的245-293位上缺失49个碱基,经鉴定定义该毒株为经典野毒株。